162875. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-tirozin-O-szulfát-csoportot tartalmazó peptidek előállítására
3 162875 4 nos módon történik. Az új vegyületek egy-egy adagja változhat 10"5 és 10 -7 mg/kg testsúly között. A találmány szerinti eljárással készült új peptidek sókká is átalakíthatók. Ilyen sók például a hidroklorid, hidrobromid, acetát, fluoracetát (például itrifluoracetát), klóraoetát (például diklóracetát), továbbá ammóniumsók, minit a diciklohexilammóniuniisó, trietilammórúumsó, níorfoliniumsó, piridiniumsó, továbbá fémkationokat tartalmazó sók, például a nátrium-, káliumvagy magnéziumsók. A találmány szerinti eljárással előállítható aminosavkombinációk közül a leghaitásoabbnak bizonyult a terc-bútoxikarbonil-L^aszpargil-O-O-szulfáto-I^tirozil-L-metionil-glicil-L-triptofil-L-métibnil-L-aszparagil-L-fenilalanin-amid ! (1. példa). A találmány értelmében :az új pepitidek és az előállításuk során használit közbülső termékek a peptidkémiában ismert módszerek szerint; állíthatók elő, például egyes aminosavaknak lépésre való kapcsolásiával vagy aminosavcsoportok kapcsolásával. Rpnt ismeretes, ez úgy történik, hogy az aminosav vagy aminocsoport aminoGsoportjáit megvédjük, például benzilioxikarboiul-származékká való átalakítással, majd az ilyen aminosav vágy aminosavcsoport karboxilcsoportját aktiváljuk, például nitrofenilészter származékává való átalakításával. Az ilyen védett és aktivált közbülső terméket azután egy szabad aminocsopontot tartalmazó másik aminosavval vagy aminosavcsoporttal reagáltatjuk, ily módon meghosszabbítva a peptidláncot. Alkalmas aikjtíváló csoportok például az aminosav savfunkcióját reaktívabbá tevő kombinációk vagy csoportok, mint a vegyües anhidridek, azidok, savkloridok, karbodiimidek reakciótermékei, reakcióképes' N-acilvegyületek, O-acil-hidroxilamin-^származékok és aktív észterek, mint az elektronbefogó (negatív) szubsztiituenseket tartalmazó alkilészterek, vinilészferek, enolészterek, fenilészterek, tiofenilészterek, niitrofenilészterek, . 2,4-dinitrofenilésziberek, triklórfenilészterefc és nitrofeniltiolészterek. A nitroferíilészterek használata különösen előnyös a hozam, melléktermékeik hiánya és ennélfogva a könnyű tisztíthatóság szempontjából. Peptidsorozatoknak a találmány szerinti létrehozása során az aminofunkciók megvédbetők az e célra használatos védőosoportokkal, mint a benziloxikiarbonil-, nitrobenzükarbonil-, metoxibenzilkarbonil-, iterc-butoxikarbonil-, ftalil-, o-nitrofenilszulfonil-, tozil- és hasonló csoportok. A karbonilcsoporitok megvédésére metil-, etil-, terc.-butil-, benzil-, nitrobanzil-, trimetilbenzil-és hasonló csoportok használhatók. A hidroxilcsopomtok megvédhetők benzil-, terc-butil-, tatrahidropiranil- és hasonló csoportokkal. A védőcsoportok ismert reakciókkal távolíthatók el, ilyenek a nátriummal cseppfolyós ammóniában végzett redukció, hidrogénezés (pl. palládiumszén katalizátor jelenlétében), hidrogénhalogeniddel (pl. hidrogén bromiddal vagy sósavval) való kezelés ecetsavban vagy trifluor-5 ecetsavas kezelés. A szabad aminők előállítására ecetsavban való hidrogénhalogenides kezelés után a hidrobromid sót egy ioncserélő gyantával, például Amberlite IR 400-zal hozzuk érintkezésbe, vagy 10 egy bázissal, például trietilaminnal közömbösítjük. Ha a kívánt pepetidsorozat létrejött, annak tirozin részét szulfatáljuk piridinnkéntfíoxid komplexszel való kezeléssel, és így a itirozin-O-15 -szulfátot tartalmazó peptidekhez jutunk. Egy csoportnak, amilyen a tirozin-rész, a szulfatálása piridin-kéntrioxid komplexszel való kezeléssel jól ismert művelet. 20 A szulfatálásit piridinnkéntrioxid komplexszel előnyösen úgy végezzük, hogy a pepiidet egy iners oldószerben, például dimetilformamidban oldjuk, piridint adunk hozzá, majd hozzáadjuk a piridHukéntr-ioxid komplexnek egy iners oldó-25 szerrel, például piridinnel készült oldatát. Szobahőmérsékleten állni hagyva létrejön a tirozin-O-szulfát-származék, és az vákuumban való bepárlás és a maradóknak vízzel való mosása után a szokásos módon elkülöníthető. A peptid 30 aiminofunkcióját a szulfatálás közben védeni kell, például egy védőcsoporttal, mint a terc-butiloxikarbonilcsoport; ez utóbb hagyományos módon, például tmfluorecetsavval eltávolítható. A szulf atált tennék ek sói a szulf atált fermék-38 nek a megfelelő savval,, aminnal vagy fémes kationnal való reagáltatásával állíthatók elő. 1. példa:" 40 terc-Butoxikarbonil-L-aszparagil-Ö^szulfáto-L-tirozil-L-metionil-gilicil-L-!triptofil-L-metionil-L-aszparagil-L-fenilalanin-amid 45 350 mg (0,3 mmól) terc-butoxikarbonil-L-aszparagil-L-tirozil-L-metionil-glicil-L-triptofil^ -L-metionil-L-aszparagil-L-fenilalanin-amidot feloldunk 18 ml vízmentes dimetilformaimid és 18 ml frissen desztiUált piridin elegyében. Eh-50 hez áz oldathoz hozzáadjuk 936 g piridinszulnak 18 ml dimetilformamíddál készült oldatát. A kapott oldatot 17 óra hosszat szobahőmérsékleten (tartjuk, majd vákuumban bepároljuk. A száraz maradékot (több ízben 15 ml vízzel 55 mossuk, és vákuumban szárítva 395 mg reakeióterméket kapunk. A kapott nyers oktapeptidszulfátot feloldjuk 0,1 mólos aimmóniumkarbonát oldatban, és DEAE-Sephadex A—25 oszh lopon kromatografálva tisztítjuk. Az 1,5 cm 60 átmérőjű és 15 om magas oszlopot összesen 350 ml 0,1 mólos és 350 ml 1,5 vizes amimóniumkárbonát oldaitból készült lineálisan növekvő koncentrációjú elegyekkel eluáljuk, és 7 ml-es frakciókat gyűjtünk, és ezeket 253 m/*-63 nál észlelhető ultraibolya elnyelésre vizsgáljuk. 2