162857. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új, lassú hatású alfa- és béta-glükopropteidek előállítására mikróba-tartalmú oldatokból vagy szuszpenziókból
162857 eredetű oldat álljon rendelkezésre, melynek nincsenek antigén tulajdonságai és csak a feloldott mikrobák ténylegesen aktív frakcióját tartalmazza. Az ilyen tisztított frakcióknak még azzal az 5 előnyös tulajdonsággal kell rendelkeznie, hogy immunitási területe széles, hatása gyors és elég hosszú ideig tart. Egy ilyen készítmény előállítására az első próbálkozásokat Lalouette P. tette meg (Revue 10 d'Immunologie 32 (1968) 105—150), aki Bacillus Subtilis L.-ből vont ki antigén hatású anyagot. A Lalouette P. által előállított anyag glüfcoproteid frakciójának antigén hatása már nemspecifikus volt. A készítmény gyulladásgátló 15 tulajdonságokkal is rendelkezett. A találmányunk szerinti eljárás e problémakörnek egy általánosabb és kielégítőbb megoldását nyújtja. A találmány lényege az, hogy nem egy egye- 20 di, nem-patogén baktérium-telep kivonatából • indulunk ki, hanem, több fajta szaprofita és patogén baktérium-telepet extrahálunk, az extraktumból előállítjuk a glükoproteid frakciót, melynek immunhatása az eddigieknél sok- 25 kai erősebb és szélesebb spektrumra terjed. Hasonló módon előállítható egy olyan frakció is, mely az eddigieknél jóval erősebb gyulladásgátló tulajdonságokkal is rendelkezik. 30 Meghatározott kísérleti körülmények betartásával egy vagy többfajta glükoproteid-típust tartalmazó készítményt állíthatunk elő mely rendelkezik a mikróbapreparátumok antigén és gyulladásgátló hatásával. Ez a frakció valószínű- 35 leg teljesen más, mint a Lalouette P. által előállított anyag, egyrészt azért is, mert teljesen eltérő mikroba-kultúrákból készült. A jelen találmányunk szerinti eljárással olyan tisztított frakció állítható elő, amely jól reprodukálható, 40 a patogén anyagokkal szemben meghatározott immunhatással rendelkezik és melvek aktív glükoproteid-tartalmát kémiai, fizikai, immunológiai, vagy bafcterológiai módszerekkel pontosan meg lehet határozni. 45 Amennyire az eddigi vizsgálatokból megállapítható, az előzőekben leírt módon előállított baktérii ím -^készítmények glükoproteid frakciója az <rr- és /?-glükoproteidnek keveréke. Struktúra jukra elektroforetikus viselkedésük alapján 50 lehet következtetni, összehasonlítva azt más ismert glükoDroteidekkel, elsősorban a selyemfehérjéből előállított glükoproteiddel. Az előállított anyag vegyi szempontból jól 55 jellemezhető a benne levő hexózok és pe-itózok mennyiségével, átlagos molekulasúlyával, és szelektív kromatográfiás módszerek .alkalmazásával. Kromatográfiás töltetként jól használható a különböző * módosított cellulózé, a szefadex (>o vagy általában a molekulasziták. A glükoproteid molekula proteintartalma megállapítható a biuretképzés reeakcióval, összehasonlítva a szériumalbumin biuret reakciójával, továbbá a hexózaminok és a szciálsav-tartalfun rnegíiatá- r<> rozásával. Az említett különböző baktériumkultúráikból előállított glükoproteid-frakciók termostabilisak, savban oldhatók és ammóniumszulfát oldatban is oldódnak, a és /f-glükoproteidek keverékei. Az 17- és a i/J-glükoproteidek molekulasúlyát kromatográfiás úton határozhatjuk meg szefadex-oszlopoin. A szűrlet fcromatográfiájával megállapítható a Ve/Vo térfogatarány, ahol Ve azt az oldószer-térfogatot jelöli, mely szükséges a glükoproteidek teljes deszorpció jához és Vo azt a szükséges oldószer-térfogatot jelöli, mely akkor szükséges a teljes molekula feloldásához, ha nincs jelen Sephadex G 100 gél. A találmányunk szerint előállított glükoproteideknél a Ve/Vo molekuláris térfogatarány az 1. példában ismertetettek szerint 2,5 és 3 között van pH = 8 értéket biztosító pufferoldathoz viszonyítva. A pufferoldat összetétele a következő: Wsz-(hidroximetil)-aminometán 0,1 mól nátriumklorid 0,1 mól Sephadex G 200-on végzett kromatográfiával megállapíthatjuk az a- és a ^-glükoproteidek molekulasúlyát is. A 2—7. példákban előállított glükoproteideknél a Ve/Vo molekuláris térfogatarány 1 és 1,2 között van az említett pufferoldathoz viszonyítva. A glükoproteidek egyébként hexóz-tartalmuk alapján is jól definiálhatók. Az össz-hexóz mennyiségét speciális reakcióval, pl. az orcinnal adott színreakcióval lehet megállapítani. E meghatározás szerint az 1. példában előállított glükolproteidekben az össz-hexóz tartalom 4 és 20% között van. A hexóz mennyisége függ a szóbanforgó frakció tisztítási fokától és attól is, hogy a glükoproteid-frakcióban mennyi anorganikus só is van. A 2. példában előállított glükoproteideknél az összhexóz-tartalom 50% körüli, ha a termék még anorganikus sókat is tartalmaz. Ha az ásványi sókat eltávolítjuk, az összhexóztartalom 60% körüli mennyiséget ér el. A glükoproteideket jellemezni lehet még az összhexóztartalom és a belőlük fejleszthető biuret hányadosával. A biuretet adó anyagok mennyiségét a szérium-albumin etalonnal való összehasonlítással állapítjuk meg. Az 1. példában előállított glükoproteideknél ez kb. 10%. Az összes hexóztartalom biuret képző anyagok hányados 0.25 ós 2 között változik a tisztasági fok függvényében. A 2. példában előállított glükoproteideknél e hányados értéké 3 vagy annál kisebb. Jellemezhetők még a glükoproteidek különböző oldhatóságuk alapján is. Desztillált vízbei*
