162835. lajstromszámú szabadalom • Vacina csirkék marek-féle megbetegedéssel szembeni immunizálására
5 ugyanis ezek a sejtek könnyén fertőzhetők és gyorsan növekednek. Laboratóriumi körülmények között az első tenyésztési lépést úgy végezzük, hogy a heparinnal kezelt vérből, vagy az előzetesen foszfátpuffert tartalmazó sóoldattal mosott és tripszinnel kezelt veseszövetekből származó megfertőzött sejtekkel 24—48 órás egyrétegű csirkevese-, csirkeembrió-kötőszövet- vagy kacsaembrió-kötőszövet-sejttenyészetet oltunk be, majd a sejttenyészetet több napon át nedves, 3—4P/o széndioxidot tartalmazó légtérben 37 C°-on tartjuk, miközben a tenyésztési közeget periodikusan cseréljük. Valamennyi következő tenyésztési lépésben a felső sejttenyészet-közeget dekantálással vagy leszivatással eltávolítjuk, a sejtek elkülönítése érdekében a közeghez tripszint adunk, majd a sejteket kismennyiségü tenyésztési közegben diszpergáljuk, friss egyrétegű sejttenyészetre helyezzük, és a fenti módon ismét elszaporítjuk. Az egyes tenyésztési lépéseket akkor fejezzük be, amikor az egyrétegű sejttenyészet sejtr jeinek legalább 75%-a megfertőződött. A preparátumban lévő sejteket megszámláljuk, és meghatározzuk a fertőzöttség mértékét. (A tripszinben diszpergált sejteket mikroszkóp alatt könynyen megszámlálhatjuk. A meghatározást úgy is végezhetjük, hogy egy megfertozetlen egyrétegű csirke vese-sejttenyészetet vagy azzal egyenértékű más tenyészetet ismert mennyiségű, megfertőzött tenyészetből származó sejttel oltunk be, az inokulumot ezután meghatározott ideig, rendszerint 4—7 napig tenyésztjük, és ^megszámláljuk a vírus által okozott foltokat. Így nagymértékben reprodukálható adatot kapunk a fertőzőképesség jellemzésére; ezt az adatot foltképző egységekben — FKE — fejezzük ki.) A fentieknek megfelelően a vírussal megfertőzött sejteket sejttenyészetben sorozattenyésztésnek vetjük alá mindaddig, amíg megfelelő mennyiségű megfertőzött sejtet kapunk. Megfelelő mennyiségű megfertőzött sejt előállításához 5—11 egyszeres ill. többszörös tenyésztési művelet elegendőnek bizonyult, ugyanakkor a vírus a tenyésztés során nem gyengült le. A többszörös tenyésztésekhez szükséges sejtszámot több egyszeres tenyésztéssel érjük el, amelyek mindegyike megtízszerezi vagy megszázszorozza a megfertőzött sejtek számát. Így pl. 10 FKE-nál kisebb mennyiségű megfertőzött sejtet tartalmazó vérminta vagy vese-sejt-minta hat vagy hét egyszeres tenyésztés után legalább 105 FKE-nek megfelelő mennyiségű megfertőzött sejtet tartalmaz. Az így kapott megfertőzött sejttenyészetet számos egyéb sejttenyészet beoltására használhatjuk fel. Az utóbbi tenyészetekben ezután megtízszerezhetjük, ill. megszázszorozhatjuk a megfertőzött sejtek számát, majd a kapott vakcinát kisebb adagokra oszthatjuk. A vakcinát a kezelési programtól és az alkalmazott dózis nagyságától függő mennyiségben 162835 6 és koncentrációban állíthatjuk elő. A szokásos laboratóriumi gyakorlatban egy tenyésztés'sorozattal kb. 109 sejtet termelünk, a sejteket elválasztjuk a tenyésztési kőzettől, tnpszinnei 6 kezeljük, és 100 ml, 10% dimetilszulfoxidot tartalmazó tenyésztési közegben újra szuszpendáljuk. Ezzel az eljárással olyan vakcinát kapunk, amely ml-ként kb. 5X107 vírussal fertőzött sejtet (=107 FKE(ml) tartalmaz. 10 A fenti vakcinamennyiséggel egymillió csirkét olthatunk be; az állatoknak kb. 5X10-' sejtet (= 103 FKE vakcinadózist) adunk. A fenti módon kapott 100 ml vakcinát általában 100 db 1 ml-es fiolába osztjuk szét; a vakcinát folyé-15 kony nitrogénáramban lassú ütemben megfagyasztjuk, és így tároljuk addig, amíg immunizáláshoz, vagy további mennyiségű vakcina előállításához oltóanyagként fel nem használjuk. 103 FKE dózis elegendőnek bizonyult a teljes 20 immunitás megszerzéséhez. Káros mellékhatás még 7X104 FKE dózisok beadásakor sem lépett fel. Az AHIV nem-patogén jellege a virus természetéből adódik, és nem a vírus legyengításének következménye. 11 lépéses tenyésztés 25 után a vírus legyengítetlen marad, amit az igazol, hogy az A-antigén az utolsó tenyésztési lépés után is kimutatható. Tekintettel arra, hogy a hasonló típus herpesvírust, az MBHV-t legalább 33-szoros tenyésztésnek kell alávetni 30 ahhoz, hogy a vírus legyengüljön, várható, hogy az AHIV esetén a 11 tenyésztési lépés nem befolyásolja a vírus aktivitását. A 2. táblázatban az AHIV vakcinával immu-35 nizált, majd élő MB-vírussal megfertőzött állatokkat végzett kísérletek eredményeit ismertetjük. 2. táblázat 40 MB- A virus Vakcina*1 ' A fertőzés reakció* 3 ' elkülönítése' 4 ' módja*2 ' % MB AHIV AHIV kontakt 0 4/8 8/8 AHIV intra-abdom. 0 5/7 6/7 AHIV — 0 0/6 6/6 — kontakt 75,0 1/3 0/3 50 — intra-abdom. 62,5 1/3 0/3 — — 0 0/6 0/6 MB-virus 57,1 1/2 0,2 Megjegyzések: 55 (1 ) Az 1. sz. vakcinából 0,2 ml-t intraabdomínáiisan 1 napos szárnyasuknak adtunk be. A szárnyasok 7,0X10'"' FKE niennyiségű vírust tartalmazó vakcinát kaptak. (2 ) A szárnyasokat Marek-féle megbetegedésfiO ben szenvedő csirkék vérével intraabdominálisan fertőztük meg, vagy úgy jártunk el, hogy a kísérleti szárnyasokat a Marek-féle megbetegedés kórokozójával megfertőzött 5 hetes szárnyasokkal azonos ketrecben tartottuk. rt5 (:t ) A kísérleti, idö 21) hét volt. A kísérleti idő 3
