162200. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-glutamináz előállítására
162200 11 12 O as-i f—1 o c 8 'S co fi J* as 8 'S co fi C '^ BÍ a o 43 ^0 -aj •£ o 2 ft* o '01 co 01 -a) 1 u tu -aj •£ o 2 ft* o 01 E u 01 E-> 1 Q) H g 31 A 0—360 2,4 43,3 104 000 37,7 B 360—450 1,2 24,3 29 000 10,5 C 450—510 2,0 15,0 30 000 10,9 nálást. Az alábbi táblázatban láthatók a menynyiségi arányok: c) 2,2 g L-glutaminázt, melynek aktivitása 43,3 E/mg, 44 ml borátpufferoldatban (pH = 8,5) feloldunk, az oldatot 20 000 g-vel centrifugálva derítjük, majd a 6b példában leírt eljárással analóg módon frakcionáljuk 2-metilpentán-2,4-diollal. A mennyiségi arányokat az szemlélteti: alábbi táblázat 10 15 20 25 a fa T3 5 s 3 ° O. O O j-< U ij-Qt o P-l '00 G cö 43 o> fi CB 01 A B 0—30 30—45 16,4 5,65 2,3 54,0 4,2 33,9 10. példa 5,65 g glutaminázt, melynek aktivitása 54 E/ mg, poli-propilánglikollal (ms = 620) újra frakcionálunk. A mennyiségi arányokat az alábbi táblázat szemlélteti: ^ o i CM" fi •co fi CS 43 8 'S C0 fi 30 o fi CO 43 i fi C0 43 4-a e i 4*1 c '2 O 43 -g S £ ^o "2 Ol a Ol 'Ol '01 CO >o 3 ° a o CA 'CD '01 1 u fa ~ E 01 h E 3 Ol 6 u 0) tat £ a aj o H H g N Sri < já 35 u a a u fa S-l ^ia o fti a» Ol s u o> t-i 01 E S-l Ol E-t A 0— 22 210 11,67 2 450 2,6 35 A 0—30 505 30,0 5,0 B 22— 44 440 15,67 6 900 .7,2 B 30—35 420 65,8 9,1 C 44— 66 539 81,67 44 050 46,2 C 35—40 1200 84,2 34,1 D 66—100 100 7,50 750 0,8 40 D 40—45 1000 94,2 30,9 8. példa Nyers glutamináz frakcionálása 3-metoxi-bu- 45 tanollal 50 g sejttömeget, melynek hatóanyagtartalma 1,6 E/mg, 1 liter m / i5 citrátpufferoldatban (pH = 5,0) szuszpendálunk, a szuszpenziót szobahőmérsékleten 2 órán át keverjük, majd 20 000 g-vel 50 centrifugáljuk. Ezt az extrahálást kétszer végezzük el, és így összesen 920 ml felülúszó oldatot kapunk. A 6b. példában leírt eljárással analóg módon, 3-metoxi-butanollal végzett frakcionálás eredményeiképpen kiemelkedően jó frakciót 55 kaptunk, mely 6900 ml és 11500 ml oldószer hozzáadása között csapódott ki. 11. példa 1,5 g dúsított L-glutaminázt, melynek aktivitása 83 E/mg, 90 cm hosszúságú, 3,0 cm átmérőjű oszlopon frakcionálunk. Az oszlop töltete: Sephadex G 200; oldószer: 0,05 mólos trisz^puffer (pH = 8,0), konyhasóra számolva az oldat 0,1 mólos, nátrium-etilmenkuritioszalieilát-tartalma 1:80 000. A kapott kiemelkedően jó aktivitású, azaz 135 E/mg aktivitású frakció enzimaktivitása további frakcionálással már nem növelhető. Ezt a frakciót elektroforézises és immunelektroforézises vizsgálatok eredményei alapján egységesnek találtuk. 9. példa 251 g nyers glutaminázt, melynek aktivitása 3,6 E/mg, feloldunk 5 liter borát-pufferoldatban (pH = 8,5), majd a 6. példában leírt módon poli-60 12. példa 50 mg L-glutaminázt, melynek aktivitása 135 E/mg, 1 ml telített, vizes glutaminoldatban felpropilénglikollal (ms = 620) végezzük a frakció- 65 oldunk, és az oldathoz addig adunk 2-metilpen-6
