162200. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-glutamináz előállítására
7 az eddig ismert eljárásokkal, pl. a L-glutamináz ammóniumszulfáttal való kicsapásával szemben: 1. A Pseudomonas aureofaciens ATCC 13985 törzs alkalmazásával a találmány szerinti módszerrel nagy mennyiségben lehet egy eddig ismeretlen tulajdonságokkal rendelkező L-glutaminázt előállítani. 2. Gyakorlatilag tetszés szerinti mennyiségű kiindulási anyagot lehet a feldolgozás céljából beadagolni. 3. Viszonylag tömény vizes oldatban végezzük a reakciót. Ebből az oldatból kicsapószerekkel vagy liofilizálással könnyen elkülöníthető az enzim. 4. A diolok vagy a polialkilénglikol feleslege acetonnal való mosással és/vagy vákuumban való szárítással könnyen eltávolítható. A Pseudomonas aureofaciens ATCC 13985 alkalmazásával előállított purissimum minőségű L-glutamináz fajlagos aktivitását még nem ismerjük pontosan. A találmány szerinti eljárás tetszés szerinti megismétlésével lehetővé válik a fenti minőségű készítmény előállítása. Tehát a találmány szerinti eljárással készített L-glutamináz a tisztított, kirstályos L-glutamináz előállítására alkalmas termék. A találmány szerinti eljárással előállított L-glutamináz olyan daganatok gyógykezelésére alkalmas, amelyeknek növekedéséhez L-glutamin szükséges. Az L-glutaminázt vizes, izotoniás injekciós-oldatok formájában, intravénásán adjuk be. Az L-glutaminázt célszerűen úgy kristályosítjuk, hogy a tisztított készítményt kevés vízben feloldjuk, majd addig adunk az oldathoz valamely oldószert, míg az oldat zavarosodni kezd. Bizonyos idő múlva megindul a kristályosodás. Előnyösen szubsztrátum, tehát L-glutamin vagy L-aszparagin jelenlétében végezzük a kristályosítást, és kicsapatószerként 2-metilpentán-2,5--diolt használunk. Ha Röntgen-szerkezetelemzéshez szükséges, nehézfémek is beépíthetők a kristályokba. A nátrium-molibdát erre a célra különösen alkalmasnak bizonyult. Az enzim fajlagos aktivitását nem lehet sem egyszeri, sem többszöri kristályosítással növelni. 1. példa 30 C°-on, ferde agáron (Bacto-Penassay Agar, Difco) tenyésztett Pseudomonas aureofaciens ATCC 13985 tenyészetet 4,0 ml 0,9%-os, steril, NaCl-oldatban szuszpendálunk. 100 ml steril, 2,0 térf.%-os, tisztára szűrt kukoricalékvárt (pH = 7,0) beoltunk a fenti baktériumszuszpenzió 2,0 ml-es részletével, és 8 órán át, 30 C°-on 1 literes Erlenmeyer-lombikban rázógéppel rázatjuk az elegyet. Az így kapott rázótenyészettel való beoltassál készítjük a fermentor-tenyészeteket. 8 liter tápoldat összetétele: 64 g L-glutaminsav 48 g glicerin 8 24 g tejsav 9,2 g K2 HP0 4 5,05 g KH2 P0 4 1,12 g MgSC-4 5 0,048 g FeS04 0,048 g MnSCv, 8,0 liter vízvezetéki víz Az oldathoz annyi 1 n nátronlúgot adunk, amennyi a pH 7,0 beállításához szükséges, 10 li-10 teres üveg-fermentorban 30 percen át 115 C°-on sterilezzük az oldatot, majd lehűlés után beoltjuk a fenti Pseudomonas aureofaciens ATCC 13985 tenyészet 25 ml-es részletével. A fermentlevet percenként 4 liter 30 C°-os levegővel le-15 vegőztetjük, a keverőt percenként 200 fordulattal működtetjük. A fermentor-tenyészet pH-értéke 5—6 óra alatt a kezdeti pH 7,0-ről pH 7,5-re növekszik. Ezután 14 órán át percenkent 1,5 liter CO2 gázt vezetünk be a növekedő tenyészet-20 be. Ezalatt a pH-érték kb. 8,0-ra melekedik. Az oldat L-glutamináz-aktivitása kb. 8,3 E/ml. A baktérium-sejttömeget a fermentléből centrifugálással eltávolítjuk, és desztillált vízzel 25 szuszpendáljuk; a szuszpenzió térfogata 0,32 liter. A baktériumok kicsapása céljából a szuszpenziót 8 liter acetonba öntjük, még 4 liter acetont adunk az elegyhez, és a kicsapódott sejttömeget ülepítjük. A felülúszó oldatot dekantál-30 juk, a csapadékot szivatószűrőn friss acetonnal mossuk, majd vákuumban 30 C°-on megszárítjuk. 35,6 g szárított sejttömeget kapunk, melynek L-glutamináz-aktivitása 1,63 E/mg. 35 2. példa 8 liter, az 1. példában leírt módon készített fermentléhez 8 liter acetont adunk és az elegyet 40 erősen keverjük. A kicsapódott sejttömeget leülepítjük, a felülúszó tiszta oldatot dekantáljuk, a csapadékot kétszer mossuk 4—4 liter friss acetonnal, majd szívató szűrőn ismét mossuk kevés acetonnal, és végül vákuumban 30 C°-on meg-45 szárítjuk. 39 g szárított sejttömeget kapunk, melynek L-glutamináz-aktivitása 1,2 E/mg. 3. példa 50 Nyers glutamináz előállítása acetonnal való kicsapással. 1,200 g sejttömeget, melynek hatóanyagtartalma 1,6 E/mg, 21 liter m / 15 citrát-pufferoldatban 55 (pH = 5,0) szuszpendálunk, a szuszpenziót szobahőmérsékleten 2 órán át keverjük, majd hűtés közben 20 000 g-vel centrifugáljuk. A felülúszó oldatot azonos térfogatú acetonnal keverjük öszsze, a kiváló csapadékot egy óra múlva percen-60 ként 3000 fordulattal lecentrifugáljuk, acetonnal mossuk és megszárítjuk. A sejttömeget a fenti módon még egyszer extraháljuk. Termelés: 321,2 g; E/mg = 4,2. Az E-re vonat-65 koztatott termelési hányad: 75,2%. 4
