161900. lajstromszámú szabadalom • Eljárás anti-alfa1-fetoglobulin tartalmú, elsődleges rákos májdaganat diagnosztizálására alkalmas szer előállítására

161900 9 10 gű normális emberi szérumra és antiszérumra van szükség. Viszont a találmány alkalmazása esetén 0,1—0,35 rész normális emberi szérumra van szükség 1 rósz antiszérutmihoz. Ezen felül a találmány szerint- kapott antiszérum antitest titere a standard antigénnel szemben 2—ö-szorosa a nyert antiszéruménak. A fent leírt műveletekkel nagy mértékű tisztítás érhető el. Azonkívül a találmány szerinti módszer mentes az eddig elkerülhetetlennek tartott fogyatékosságoktól. Például nagy mennyiségű normális emberi szérum használata nemcsak gazdaságilag volt hátrányos, hanem az antitest titer csökkenésével is jáiihatott anti-tainfetoglobulin egyidejű kiválása következtében. Azonkívül ezekkel a műveletekkel nemi volt leküzdhető az anti-ai-makroglobulin és hasonló anyagok albszorbeálásának nehézsége. Találmányunk lehetővé teszi jó minőségű antiszérum előállítását rendkívül kevés normális emberi szérűim felhasználásával. Ezenkívül az antiszéruimot nem fertőzi anti-ci2--makroglobulin és hasonló anyagok. További meglepő tény, hogy a találmány szerint készült antiszénucm antitest titere sokkal nagyobb, mint a fent említett hagyományos eljárással kapható antiszénumé. Az így előállítható antt-ai-fetoglobulin szérumot azután vagy feloldjuk egy pufferoldatban egy hordozóközeggel együtt, vagy egy hordozón adszorlbeáltatjuk és egy diszpergáló közegben diszpergáljuk, amikor is kiváló diagmosztizálószert kapunk. A találmány szerinti diagnosztizálószer célja általában teljes mértékben megvalósítható a fent leírt módon kapott anti-^ai-fetoglobulin felhasználásával. Mindamellett, ha szokatlanul tiszta diagnosztizálószert kívánunk előállítani, például kísérleti célokra, akkor az ai-fertogiolbuliint rendkívüli mértékben meg kell tisztítani. Az ilyen különlegesen jó minőségű ai-fetoglobulin előállítása szintén tárgya a találmánynak. Az alábbiakban eljárást ismertetünk egy primer hepatómiában szenvedő beteg hasvizének vagy szérumának vagy egy emberi magzat szérumának tisztítására oly módon, hogy a hasvizet vagy szérumot akrinollal szemlben dializáljuk, és a dializátumlból kapott csapadékot fehérje frafccionálással tisztítjuk. Ennek során a hasvizet vagy szérumot eredeti térfogatának 3—ötszörösére hígítjuk, és 0,1—0,01 s/tf%-os vizes akrimol oldattal szemben dializáljuk. A dialízist akrinollal szemben a szérummal vagy has vízzel belső fázisként kib. 24 óra hosszat végezzük. Ezután a kapott ákrinolos oldatot centrifugáljuk vagy másként választjiiik el a csapadéktól. Ez a csapadék elég tiszta ai-fetogloibulin. Minthogy azonban ez a csapadék csekély mennyiségű szennyezést, többek között aibuomint is tartalmaz, szokásos fehérje frakcionálással tisztítható még tisztább ai^fetoglofoulin előállítására. Alkalmas fehérje frakcionálási eljárások például az ammóniumszulfátos frakcionálás, dialízis, oszlopkromatogmafálás, membránszűrés, izoelektromos fraíkciamálás és hasonlók; ezek egyenként vagy szükség esetén kombinálva hajíthatok végre. A legjobb arediményt a következő műveletekkel érhetjük el. Az említett csapadékot feloldjuk például fiziológiás sóoldatban vagy egy pufiferoldathan, és az oldhatatlan anyag eltávolítása után az oldatot dializáljuk egy puftferoldattal (0,03—0,04 mól és 4,5—5,5 pH) szemben. A pufferoldat lehet például acetátpuffer, trisz^hidroklorid-nátriumikloridHpuffer, nátriumklorid^glickupuffer, barbiiturát-ipuffer, citrátpuftfer, foszfátpuffer vagy borátpuffer. A diializátumot ezután feltöltjük egy kariboximetilcellulóz oszlopra (0,03—0,04 mól, 4,5—5,5 pH) és eluáljuk 0,03—0,04 móltól 0,2 mólig. Ily módon a kívánt ai-fetoglobulin ehiálódik az oszlopról kb. 0,055 móltól kezdve. A kaipott frakciókat egyesítve tiszta ai-fetoglobulint kapunk. Karboximetilcellulózon kívül az oszlopkromatografálás végrehajtható más anyagokkal, mint a DEAE-cellulóz és TEAE-cellulóz és hasonlók. Az oszlopkromatogratfálást ajánlatos kétszer vagy többször megismételni, legalább egyszer karboximetilcellulózzal. Minthogy a leírt műveletekkel tiszta, szennyező fehérjéktől csaknem teljesen mentes ai-fetoglobulint kapunk, ez a módszsr a legalkalmasabb antigén tisztítási módszer a találmány szerinti diagnosztizálószer előállítására kutatási célokra a következő okokból. Kívánatos, hogy a diagnosztizáló szer készítésére használt ai-fetoglofoulin nagyon tiszta legyen. Ha viszonylag niagy mennyiségű szennyezést tartalmazó ai-ístoglobulint használunk fel kiindulási anyagként, akkor az ezeknek a szennyezéseknek megfelelő antitesteiket el 'kell távolítani a diagnosztizáló szer előállítása során. Ez az eltávolítás nemcsak bonyolult műveletekkel jár, hanem lényegesen csökkenti a termék hozamát is. Az ai-fetoglobulin kinyerésére és tisztítására a következő módszerek ismeretesek: a) Bergstrand és Czar magzatszérumból indultak ki, és azt elektroforetikusian frakcionálták. Az ai-fetoglobulin az albuminnial összeeső ponton jelent meg, és közölték, hogy csekély különbséget találtak a molekulasúlyban ultraeentrifugálással meghatározva. [Scand. J. Clin. Lab. Invest. 9, 277 (1957)]. d) Dávid és munkatársai köldökszérumot bocsátottak át kétszer Sephadex G—200 oszlopon, és azt 0,1 n vizes nátriumkloriid-oldattal eluálták. Azt találták, hogy ainfetoglobulin csúcskoncentrációja összeesik a transzferrin és az albumin maximumával. [J. Clin. Invest. 45 (1966)]. c) Hirai és munkatársai magzatszérumot adszorbeáltattak egy DEAE-cellulózoiszloipon (0,02 mól, 5,5 pH), és fokozatosan eliuáltak 0,2 mólig, amikor is az anfetoglobulin az albumin csúcs vállaként eluálódott. Ezt a frakciót aztán karboximetileellulóz oszlopon (0,02 mól, 4,8 pH) adszorbeáltatták, és fokozatos eluálást végeztek 0,5 mólig. Három csúcsot kaptak, ezek közülxa • harmadak volt az ai-tfetoglabulin. Ennek a csúcs-10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5