161803. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alkálikus proteáz termelésére
3 161803 4 pergillus ochraceus törzset (1MET PA 126) vagy annak mutánsait kétlépéses szubmerz eljárásban 20 és 30 DC közötti, előnyösen 25 °C hőmérsékleten, szénforrásként dextrózhulladékot, valamint a főtenyészetben laktózt és nitrogénforrásként szójalisztet tartalmazó tápközegben keverés és levegőztetés közben tenyésztjük.' Az 1079 sz. Aspergillus ochraceus törzset ä jénai Institut für Mikrobiologie und Experimentelle Therapie intézetnél IMET PA 126 szám alatt letétbe helyeztük. A kiindulási anyag liofilizált lefölözött tejkonzerv, amely +4 °C hőmérsékleten tartással több éven keresztül azonos értékű oltóanyagot szolgáltat. Ebből a száraz konzervből a spóra tenyésztésére ferdeagar táptalajokat oltunk be. Duzzasztott, sterilizált köles szolgál a spórák 25 °C-ori történő szaporítására. Az eljárás első lépése olyan előtenyészetből áll, amelyet milliliter tápközegenként 105 —10 6 spórával beoltunk és 48 óra hosszat 25 c C-on tenyésztünk. Ennek az előtenyészetnek a 10%-át visszük át a második lépésbe. A mikroorganizmus tenyésztéséhez és a proteáz-képzéshez közel optimális feltételek megteremtéséhez az elő- és főtenyészet tápközegei változó összetételben burgonyakeményítőt, szárított keményítőszirupot, duzzasztott cellulózt, dextrózhulladékot, technikai laktózt, szójalisztet, kukoricalekvárt, élesztőautolizátumot, húskivonatot és peptont tartalmazhatnak. A tenyésztés lefolyását a proteáz-aktivitás, a redukáló anyagok, a szárazanyagtartalom és a pH-érték vizsgálatával ellenőrizzük. A proteáz-aktivitás meghatározását a Kunitzféle módosított módszerrel végezzük, kazein szubsztrátummal. 2,9 ml Britton—Robinson puffert (pH=6,0) és 0,1 ml tenyészoldat szürletet 0,3 ml 3%-os kazeinoldattal 37 °C hőmérsékleten 30 percig inkubálunk. Ezután a nem lebontott kazeint 3,0 ml 10%ros triklórecetsavval kicsapjuk és centrifugáljuk. A triklórecetsavban oldódó lebomlási termékek extinkcióját „Spektromon" spektrofotométerrel mérjük 280 nm hullámhosszán. A vakpróba az azonos összetételű minta extinkciója inkubálás nélkül. Számítás: CE/ml=E7-—Ey; Er = a vizsgálati minta extinkciója és Ev = a vakpróba extinkciója. Különböző pH-értékek mellett az Aspergillus ochraceus-proteáz aktivitását az 1. ábra és pH-stabilitását 3 óra elteltével a 2. ábra mutatja. 1 példa: Első lépés: előtenyésztés. 500 ml-es szélesszájú Erlenmeyer lombikban 100 ml 5% dextróz dextrózhulladék 3% kukoricalekvár 0,5«/o CaC03 0,3% (NH4 ) 2 S0 4 mellett vízvezetéki vizet tartalmazó tápközeg található. Sterilizálás után a tápközeget beoltjuk az 1079 sz. Aspergillus ochraceus törzs (IMET PÁ 5 126) 106 spórájával milliliterenként és 25 °C hőmérsékleten 48 óra hosszat rázógépen rázzunk. Második lépés: főtenyésztés. 10 A főtenyésztés tápközege 1% technikai laktózt 4% dextrózt (dextrózhulladékban) 1,5% szójalisztet 15 0,05%, KCl-t 0,05% MgSOs • 7H2 0-t 0,1% KH2 P0 4 -t 0,001% FeS04 • 7 H2 0-t 20 tartalmaz 100 ml-re vízvezetéki vízzel kiegészítve. A rázólombik ugyancsak 100 ml tápközeggel van megtöltve. A tápközeg sterilizálása és az előtenyészet 10%-ával történő beoltása után ezt 25 25 C C hőmérsékleten tovább rázatjuk. A tenyésztés ideje alatt a pH-érték 4,7-ről 6,0-ra emelkedik. A hetedik tenyésztési napon a szürletben 7 CE/ml proteázaktivitást találtunk. 2. példa: Első lépés: előtenyésztés. 35 A 40 1 tápközeg 5 % dextróz (dextrózhulladékban) 3 %, kukoricakivonat 0,5% CaC03 0.3% (NH4 ) 2 S0 4 40 0,1% habzásgátló mellett vízvezetéki vizet tartalmaz. Sterilizálás után (120 °C-on 60 percig) tápközeg literenkén. az 1079 sz. Aspergillus ochraceus törzs 5 • 108 45 spórájával oltjuk be. A tenyészetet tápoldatliterenként 0,5 I levegő/perc sebességgel keverjük. 25 °C -on 48 óra elteltével a tenyésztést befejezzük, ezalatt a pH-érték 5,0-ről 6,0-ra emelkedik. 50 Második lépés: főtenyésztés. A 40 1 tápközeg 1 % technikai laktóz 55 4 % dextróz (dextrózhulladékban) 1,5 % szójaliszt 0,005% KG1 0,05 % MgS04 -7H 2 0 0,1 % KH2 P0 4 60 0,001% FeS04 -7H 2 0 mellett vízvezetéki vizet tartalmaz. Sterilizálás után (100 °Crön 60 percig) beoltásra az előtenyészet 10%-át visszük át. A tenyészetet lite-65 renként 0,5 l/perc levegővel levegőztetjük és 2
