161709. lajstromszámú szabadalom • Eljárás B12-vitamin kinyerésére fermentlevekből

3 161709 4 A hidrolízist 50 C° és 120 C° közötti hőmérsékleten, vizes közegben, vagy víz/szerves oldószer-elegyben, 4 és 8 pH-érték között végzik [194 532 sz. (1958) osztrák szabadalmi leírás; 198 884 sz. (1958) osztrák szabadalmi leírás] stabilizátor, azaz olyan anyag jelenlétében, amely a Bi2-vitamint stabil származékká alakítja és ezáltal a kezelés alatt való elbomlás ellen védi. Stabilizátorként cianidokat [203 630 sz. (1959) osztrák szabadalmi leírás], ammóniumrodanidot, nátriumhidrogénszulfitot, nátriumnitritet használnak. A hidrolizálandó elegyet sósavval, ritkábban kénsawal, ecetsavval, vagy oxálsavval savanyítják meg. Szokták az elegyet cianidok jelenlétében 110—120 C°-on autoklávban is melegíteni [2 941993 sz. (1960) USA-beli szabadalmi leírás]. Az extrakciót általában vizes aceton-oldattal, vagy rövidszénláncú alifás alkoholok vizes oldataival végzik [2 764 521 sz. (1956) USA-beli szabadalmi leírás; 106 979 sz. (1960) NSZK-beli szabadalmi leírás]. Némely esetben a hidrolízist is ilyen víz/szerves oldószer-elegyben végzik. A Bi2-vitaminnak a szubsztrátumból való extrahálására használatos ismert eljárások többségénél azonban nem bomlanak fel maradéktalanul az említett vitamin és a sejtszerkezet közötti kötések, ezért ennél a lépésnél jelentős vitaminveszteséggel kell számolni, mely a kezdeti vitamintartalom 40—50%-áig terjedhet. Egyes nagyon hatásos eljárások, pl. a cianidok jelenlétében autoklávban való melegítés, nagyipari alkalmazásra kevéssé alkalmasak. A Bi2-vitaminnak a szubsztrátumból való tökéletes kivonása érdekében célszerű olyan speciális faktorokat alkalmazni, amelyek a nevezett vitamint termelő mikroorganizmus élő sejtjeit gyorsan megölik, és erélyesen lebontják. A kapott hidrolizátumok és kivonatok a kobalaminokon kívül szennyezéseket is tartalmaznak, pl. ásványi sókat, fehérjéket, peptideket, színes anyagokat, stb. A szennyezőanyagok eltávolítása időigényes és bonyolult művelet; bizonyos színes anyagok eltávolítása különösen súlyos nehézségeket okoz. A kiindulási hidrolizátumok és kivonatok tisztítására sok olyan eljárást alkalmaznak, amelyek a Bi2-vitamin előállításánál nagyon elterjedtek. Az előtisztítást különféle szorpciós és ioncserélő módszerekkel végzik, melyeknél a kezelés módjától függően vagy a szennyezőanyagok, vagy a kobalaminok adszorbeálódnak, amelyeket azután, ez utóbbi esetben valamilyen módon eluálnak. Így jelentős mennyiségű kísérő szenynyezőanyag is eluálódik. A Bi2-vitamin és más kobalaminok vizes oldatból való adszorbeáltatására pl. aktív szenet használnak, majd az eluálást aceton és alkoholok elegyeivel végzik [ 2 668 137 sz. (1964) USA-beli szabadalmi leírás; 932 576 sz. (1955) NSZK-beli szabadalmi leírás]. A kobalaminokat vizes, savas közegben adszorbeáltalak montmorillonitokon, bentoniton, fullerföldön, majd vizes oldatokkal eluálják őket 6—9 pH-értéken, stabilizátorok jelenlétében [2 643 210 sz. (1953) USA-beli szabadalmi leírás; 339 323 sz. (1959) svájci szabadalmi leírás]. Az 5 említett adszorbeálóanyagok a színes szennyezőanyagok eltávolítására is használhatók. Előnyösen használható a kovaföld szennyezőanyagok oldatból való eltávolítására és kiszűrésére. A Bi2-vitamintartalmú vizes oldatok tisztítá-10 sara olykor a 'kromatográfiás célokra használatos alumíniumoxidot is szokták alkalmazni, e készítmény vizes oldatának pH-értéke = 7 (L. Smith, Bi2-vitamin, Moszkva, orosz nyelven). Ez a kezelés azonban kevéssé hatásos, és ezzel nem 15 lehet a tisztítandó oldatból az összes színes szennyezőanyagokat eltávolítani. Ezt különböző Bi2-vitamintartalmú anyagokkal végzett tisztítási kísérleteink alapján állapítottuk meg. Ioncserélőgyantákat használnak egyrészt a sa-20 vas és lúgos szennyezőanyagak eltávolítására [2 684 322 sz. (1954) USA-beli szabadalmi leírás], másrészt a Bi2-vitamin és más kobalaminok adszorbeáltatására. A kobalaminok adszorbeáltatására pl. karboxil funkcionális csoportokat tartal-25 mázó polimer kationcserélők használatosak. A kobalaminokat savas közegben a H-fázisú kationcserélővel adszorbeáltatják, majd vizes lúgoldattal eluálják [950 675 sz. (1956) NSZK-beli szabadalmi leírás]. Semleges fenolgyantákat is 30 alkalmaznak elszíntelenítés céljából. A kobalaminokat kb. 6 pH-értékű vizes oldatból adszorbeáltatják, majd sósavval megsavanyított vízaceton eleggyel eluálják [2 702 203. sz. (1955) USA-beli szabadalmi leírás]. Ismeretes az a mód-35 szer is, mely szerint a kobalaminokat cianid-ionokat tartalmazó vizes oldatból a CN-fázisú anioncserélővel adszorbeáltatják, majd vizes ecetsavoldattal eluálják [2 709 669 sz. (1956) USA-beli szabadalmi leírás]. 40 A Bi2-vitamintartalmú oldatok adszorbeálószerekkel és/vagy ioncserélőgyantákkal való tisztításának az az általános hátránya, hogy a színes szennyezőanyagok ezen a módon nem tá-45 volíthatók el tökéletesen, és a maradványaik a későbbi tisztítási műveletekben sem távolíthatók el. Az előtisztítás után a Bi2-vitamint és más kobalaminokat tartalmazó oldatokat ciamidokkal 50 kezeljük a Bi2-vitaminnak és a kobalaminoknak ciano- vagy diciano-alakba való átalakítása céljából. A ciánozott oldatokat általában különböző szerves oldószerekkel extrahálják, és többlépcsős 55 megoszlásnak vetik alá, szerves oldószereket és vizet tartalmazó, többkomponensű elegyekből álló, kétfázisú rendszerekben. E célra gyakran használják fenolok széntetrakloridos, kloroformos, propanolos, butanolos stb. elegyét [859 359 60 sz. (1952) NSZK-beli szabadalmi leírás]. A Bi2-vitamint a kísérő más kobalaminoktól metanolos, acetonos, dioxános oldatban, alumíniumoxidon való kromatografálással választják el; az említett szerves oldószereket vízzel tetsző-65 leges arányban elegyítik. Kromatografálás után 2