161558. lajstromszámú szabadalom • Eljárás biológiailag aktív pepsztatin előállítására
161558 9 pott elegyet 30 percig 37 pC-on inkubáljuk. Ezután a reakció leállítására az elegyhez 2,0 ml 1,7 mólos perklórsav-oldatot adunk. Az elegyet 1 órán át állni hagyjuk, majd centrifugáljuk, és a felső folyadékréteg optikai sűrűségét (a) 280 m« hullámhosszon megmérjük^ A pepsztatint nem tartalmazó ©legyet hasonlóan kezeljük, s ennek is meghatározzuk-az optikai sűrűségét (b). Az 10 optikai sűrűségértékekből a (b—a) x 100 egyen- 10 let segítségével kiszámítjuk a százalékos gátlást. A pepsztatinkoncentrációt és a hozzá tartozó százalékos gátlást grafikusan ábrázoljuk, így az egyes százalékos gátlásértékekhez tartozó pepsztatin- 15 koncentráció a görbéből leolvasható. Ha a reakcióelegyhe? 0,02 pg pepsztatint adunk, a gátlás 50%-os. A megfelelő tenyésztési körülmények között 20 pepsztatint termelő Streptomyces törzseket úgy kezeljük, hogy a pepsztatintermelő mikroorganizmus spóráit vagy micéliumait megfelelő táptalajba oltjuk, majd aerob körülmények között tenyésztjük. A tenyésztést szilárd táptalajon is 25 végrehajthatjuk, nagy mennyiségű pepsztatin előállítása esetén azonban alkalmasabbnak bizonyultak a folyékony közegek. A fermentálást bármely olyan hőmérsékleten végrehajthatjuk, amelyen a pepsztatintermelő törzs növekedik és 30 pepsztatint termel, a legelőnyösebben azonban 25—35 °C közötti hőmérsékleten dolgozunk. A pepsztatin előállításához a Streptomyces törzsek növekedéséhez szükséges, ismert tápanyagokat tartalmazó táptalajokat használunk fel. Nitro- 35 génforrásként pl. kereskedelemben kapható anyagokat, így peptont, húskivonatot, élesztőkivonatot, kukoricalekvárt, gyapotmaglisztet, szójabablisztet, élesztőkivonatot, N-Z amint, kazeint, nátriumnitrátot, ammóniumnitrátot, ammó- 40 niumszulfátot vagy egyéb nitrogéntartalmú anyagokat, pl. búzakorpát, rizskorpát vagy hasonló anyagokat használhatunk fel. Szénforrásként pl. a következő, olcsó és könnyen beszerezhető anyagokat alkalmazhatjuk: laktóz, glicerin, 45 szukróz, keményítő, glükóz, maltóz, melasz, egyéb szénhidrátok vagy zsírok. A szénhidrátokat vagy zsírokat nyers vagy tisztított állapotban egyaránt felhasználhatjuk. Szénforrásként célszerűen glicerint, glükózt, maltózt, dextrint vagy keményítőt alkalmazunk. A táptalajhoz nátriumkloridot, nátrium- vagy káliumfoszfátot, kalciumkarbonátot vagy magnézium-ion-forrást is adhatunk. A tenyésztést szükség esetén fémsónyomok jelenlétében végezzük. A tenyésztéshez bármely olyan anyagot felhasználhatunk, ajnely a pepsztatintermelő mikroorganizmusok pepsztatintermelését elősegíti. Általánosságban minden olyan anyagot alkalmazhatunk, amely a Streptomyces törzsek tenyésztéséhez felhasználható. A tenyésztést addig folytatjuk, amíg jelentős mennyiségű pepsztatin halmozódik fel. Így pl. az MC144—Cl törzset különféle szénforrásokat, különféle nitrogénforrásokat, 0,3% NaCl-t, 0,1% MgSO<.7H2 0-t, 0,1% K 2 HP0 4 -t és 0,1 ml/100 ml fémsóoldatot tartalmazó, különböző tápltálajokba oltjuk, és az elegyet rázógépen (amplitúdó: 8 cm, 200 löket/perc) 27—29 °C-on tenyésztjük. A fém-, sóoldat 100 ml desztillált vízben a következő oldott anyagokat tartalmazza: 700 mg CuS04 .5H 2 0, 100 mg FeSO/,.7H2 0, 800 mg MnCl 2 .4H 2 0 és 200 mg ZnSO/,.7H2 0. A tenyésztést 500 ml-es edényekben végezzük, egy-egy edénybe 100—100 ml táptalajt helyezünk. A tenyészetből naponta mintát veszünk, és 0.05 ml százszorosára hígított szűrt permetlé pepszingátló hatását vizsgáljuk. \z eredményeket a 2. táblázatban soroljuk fel. A tenyészetben már a tenyésztés második napján kimutatható a pepsztatin, és a maximális pepsztatinhozamot a tenyésztés 4—7. napján érjük el. A maximális mennyiségű pepsztatint tartalmazó táptalaj pH-ja gyakran eléri a 9,0 értéket. A pepsztatin mennyisége nem csökken, ha a tenyésztést 10 napon át 9,0 pH-értéken végezzük, ennek megfelelően a pepsztatin igen stabil vegyület. Vizsgálataink eredményeit a 2. táblázatban foglaljuk össze. A táblázat adataiból látható, hogy a pepsztatin termeléséhez számos szén-, ill. nitrogénforrást felhasználhatunk. 2. táblázat ápta Tenyésztés ideje (nap), a tenyészet pH-ja, és a százszorosára hígított 0,05 ml szűrt fermentlé száma pepszingátló hatása (%) pH % 6 pH o/„ pH pH pH % 1 7,4 9,9 6,8 24,1 7,8 8.5 14,0 8,8 2 6,9 50 7,9 84 8,1 86 8,4 88 8,7 85 3 6,2 56 8,0 71 8,4 70 8,5 75 8,7 67 4 5,3 47 5,3 64 5,4 62 5,4 55 7,2 72 5 7,8 36 8,5 39 8,8 — 8,9 48 9,0 — 6 7,9 37 8,0 32 8,6 — 8,7 37 8,8 — 7 7,6 18 7,7 29 7,9 — 8,2 22 8,6 •— 8 7,3 8,2 8,2 9,4 8,5 — 8,3 13 7,6 — 9 5,7 82 7,7 92 8,3 85 8,2 87 8,7 88
