161542. lajstromszámú szabadalom • Eljárás B-5050 antibiotikum-komplex és a komplex egyes komponenseinek előállítására

23 4. példa 120 ml n-hexán, 80 ml etiléndiklorid, 30 ml metanol és 6 ml víz elegyét alaposan összekeverjük, majd állni hagyjuk. Az elegy két fázisra válik szét. A felső fázist elkülönítjük az alsó fázistól. 6 ml alsó folyadékfázisban 1 mg klórfenolvöröst oldunk, és az oldatot az alsó folyadékfázis maradékához adjuk. Az oldathoz ezután 5 g Celit-et (kezelt diatomaföld, a Johns Manville Sales Corp., USA cég terméke; előnyösen Celit 535-öt használunk fel) és 100 ml felső folyadékfázist adunk. Az elegyet erélyesen keverjük, majd addig vezetünk bele sósavat, amíg az indikátor ibolyaszínűből sárgába csap át. A szuszpenziót ezután Celit-tel töltött üvegoszlopba töltjük. Egységes eloszlású Celit-oszlopot készítünk. 25 mg, a 3. példában előállított kristályos B—5050 antibiotikum-elegyet 0,4 ml, az előző lépésben elkülönített felső folyadékfázisban oldunk, és az oldatot a fent ismertetett módon készített Celit-oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopot a felső folyadékfázissal eluáljuk. A hatóanyag-komponensek lila sávok alakjában válnak szét. Az elúció során a következő sorrendben kapjuk az antibiotikumokat: B—5050—A, B—5050—B, B—5050—C, B—5050—D, B—5050—E és B—5050—F. A fenti eljárással kristályos termék alakjában 4 mg B—5050—A antibiotikumot, 3 mg B—5050^—B antibiotikumot, 5 mg B—5050—C antibiotikumot, 4 mg B—5050—D és B—5050—E antibiotikum-elegyet és 2 mg B—5050—F antibiotikumot kapunk. 5. példa Az 1. példában leirt eljárással Streptomyces hygroscopicus IFO—12995 oltótenyészetet állítunk elő. 200 ml-es Erlenmeyer-lombikba 50 ml pH = 7,0 értékű, 3% glükózt, 0,5% kukoricalekvárt, 1,0% zsírtalanított szójabablisztet, 0,5% nátriumkloridot, 0,05% magnéziumszulfátot, 0,1% dikáliumhidrogénfoszfátot, 0,05% káliumkloridot, 0,3% kalciumkarbonátot és vizet tartalmazó főtenyészet-táptalajt töltünk, a táptalajt sterilizáljuk, majd 2 ml oltótenyészetet adunk hozzá. A tenyésztést rázógépen, 28 °C-on, 96 órán át végezzük. Az így kapott, szűrt fermentlé Bacillus subtilis-szel szemben meghatározott antimikröbás aktivitása 350 egység. 1,6 liter szűrt fermentlé pH-ját 7,8 értékre állítjuk, és az elegyet 800 ml, majd 600 ml etilacetáttal extraháljuk. Az etilacetátos oldatokat egyesítjük, vízzel mossuk, majd 2x600 ml 0,005 n vizes sósavoldattal extraháljuk. A vizes oldatokat egyesítjük, 0,1 n nátriú'mhidroxid-oldattal semlegesítjük (pH = 7—8), majd 2x500 ml etilacetáttal extraháljuk. Az etilacetátos oldatokat egyesítjük, vízzel mossuk, vízmentes nátriumszulfát fölött szárítjuk és vákuumban bepároljuk. A maradékhoz 30 ml n-hexánt adunk. A kapott 59 mg súlyú nyers, por alakú terméket forró ben-24 zolban oldjuk, és az oldatot állni hagyjuk. 15 mg színtelen, tűs kristályos B—5050 antibiotikum-elegyet kapunk. 5 6. példa 200 ml-es Erlenmeyer-lombikba 50 ml, az 1. példában leírttal azonos összetételű főtenyészettáptalajt töltünk, és a táptalajt 2 ml, az 1. példá-10 ban leírt módon előállított oltótenyészettel beoltjuk. A tenyésztést rázógépen, 28 °C-on 96 órán; át végezzük. Az így kapott szűrt fermentlé Bacillus subtilis-szel szemben meghatározott antimikrobás hatáserőssége 350 egység. 1,8 liter szűrt fermentlé pH-ját 8,0 értékre állítjuk és 2x400 ml etilacetáttal extraháljuk. Az etilacetátos oldatot vízzel mossuk, szárítjuk, vá~ kuumban bepároljuk, és a maradékhoz 30 ml 20 n-hexánt adunk. A kapott 210 mg súlyú nyers por alakú terméket 15 ml benzolban oldjuk melegítés közben, és az oldatot állni hagyjuk. 59 mg kristályos B—5050 antibiotikum-elegyet kapunk. 25 7. péida 900 liter, az 1. példában leírt módon előállított szűrt fermentlevet az 1. példában ismertetett módon kezelünk. 70 g nyers B—5050 antibioti-30 kum-elegyet kapunk. A nyerstermék mintáját 2:1 térfogatarányú etilacetát:benzol elegyben oldjuk, és 2,1 kg szilikagélt (a fentivel azonos minőségű termék, gyártó: Merck A. G., Darmstadt, NSZK) tártai-35 mázó oszlopon kromatografáljuk. Az elegyet 2:1» térfogatrészű etilacetát-benzol eleggyel eluáljuk, a színtelen frakciókat összegyűjtjük és szárazra pároljuk. A maradékot 350 ml forró benzolban oldjuk és az oldatot állni hagyjuk. 7,0 g szinte-40 len, tű alakú kristályos B—5050 antibiotikumelegyet kapunk. 8. példa 45 800 ml, a 6. példában leírt módon előállított szűrt fermentlé pH-ját 7,6 értékre állítjuk, és az elegyet 40 ml Amberlit XAD-2 gyantaoszlopon (a Röhm & Haas Co., USA cég terméke, molekulaszita) bocsátjuk át. Az oszlopot 200 ml desztillált 50 vízzel mossuk, majd 200 ml 30%-os vizes metanollal eluáljuk. Barna, antimikrobás aktivitással gyakorlatilag nem rendelkező eluátumot kapunk. Az eluálást 500 ml 80%-os vizes metanollal folytatjuk, és a leghatásosabb komponen-55 seket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük. A frakciókat a metanol eltávolítása érdekében vákuumban bepároljuk. A tömény vizes maradékot ezután pH = 7,5—8,5 értékre állítjuk és 2x100 ml etilacetáttal extraháljuk. Az etilacetátos ol-60 datokat egyesítjük, vízzel mossuk, szárítjuk és vákuumban betöményítjük. A maradékhoz n-hexánt adunk. A kapott 53 mg nyers, por alakú terméket forró benzolban oldjuk, és az oldatot állni hagyjuk. 17 mg kristályos B—5050 65 antibiotikum-elegyet kapunk.