161454. lajstromszámú szabadalom • Eljárás cisztintartalmú peptidek előállítására
11 * 161454 12 "vizes mosás és szárítás után dimetilformamid-éter elegyből többször kicsapjuk. További tisztítás céljából metanolban oldjuk és Sephadex LH-20 oszlopon kromatografáljuk. 6)BOC- Cys-(TRI) - Tyr(tBu)-Ile-Gln-Asn- Cys(TRI) -Pro-Leu-Gly-NH2 5 2,1 g, a 2. pontban előállított tetrapepud származékot es 3.3 g BOO-CysfTRn TyrítBuV He -Gln-Asn-OH vegyületet 50 ml dimetilformamidban és 1 g N-hidroxiszukcinimid hozzáadásával oldunk. A -20°-ra lehűtött oldathoz 0,9 g diciklohexükarbodnmidet adunk és 2 órán át -20' -on, majd 10 48 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk, miközben a 6., ÍZ és 18. órában mindig további 200 mg diciklohexilkarbodümidet adunk hozzá. Ezután a kivált diciklohexükarbodiimidet leszűrjük, a szűrletet nagy vákuumban 40°-os fűrdőhó'mérsékleten kis térfogatra bepároljuk, és a nonapep- 15 tidszármazékot éter hozzáadásával kicsapjuk. A port leszivatjuk, szárítjuk, vízzel eldörzsöljük, ismét leszivatjuk és szárítjuk. Az így keletkezett nyers BOC-Cys(TRI)-Tyr-(tBU)-Ile-Gln-Asn-Cys(TRI)-Pro-Leu-Gly-NH2 vegyületet tisztítás céljából az 2. példában leírttal azonos rendszerben 20 ellenáramú megoszlatásnak vetjük alá. 5 példa 25 1 1 BOC-Cys-Phe-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys(BOC)-Gly-NH2 1120 mg jód 500 ml metanolos oldatához szobahőmérsékleten erői keverés közben 800 mg BOC-Cys (TRI) -Tyr(tBu)-Phe-Gln-Asn-Cys(TRI)-Pro-Lys(BOC)-Gly 30 -NH j 500 ml metanolos oldatát csepegtetjük hozzá 45 perc alatt. Ezután az oldatot 2°-ra hűtjük és In nátriumtioszulfát oldatot csepegtetve hozzá, elszintelenítjük. Vízsugárszivattyús vákuumban 30°-os fűrdőhőmérsékleten kis térfogatra bepároljuk és a terméket sok víz hozzáadásával kicsapjuk. Ezt leszivatjuk és vákuumexszikátorban szárítjuk. A lizin* -vazopresszinné történő átalakításához a BOC-Cys-Tyr(tBu) -Phe Gln-Asn-Cys-Pro-Lys(BOC)Gly-NH„ vegyületet keverés közben 10 ml jéghideg koncentrált sósavban oldjuk. ^ 10 perc múlva 0°-on 50 ml jeges vízzel hígítjuk és 5 ml jégecetet adunk hozzá. Ezután egy gyengén bázíkus acetát formájú, II. számú Merck ioncserélőgyanta oszlopon szűrjük és az eluátumot szárazra pároljuk. A kiindulási anyagként alkalmazott védett BOC-Cys(TRI *§ -Tyr(tBu)-Phe-Gln-Asn-Cys(TRI)-Pro-Lys-(BOC) -Gly-NH2 nonapeptidszármazékot a 4. példában leírt védett nonapeptidamidéhoz hasonló módon állítjuk elő, a BOCCys(TRI) TyrítBu) Phe Gin Asn OH és H-Cvs(TRI) Pro-Lys (BOC) - Gly - NH, diciklohexilkarbamid és- 50 N-hidroxiszukcinimid jelenlétében tonenö kondenzációjával. A közbenső termékek előállítása ugyancsak hasonló módon történik. 6. példa BOC- Cys-Phe-Phe- Gin-A sn-Cys-Pro-lys(BOC}- Gly -NH, Ezt a vegyületet az 5. példában leírtak szerint állíthatjuk 60 elő BOC~Cys(TRI)-Phe-Phe-Gln-Asn-Cys(TRI)-Pro-Lys(BOC)-Gly-NH2-vegyületből, és Phe 5 -Lys* -vazopresszinné alakíthatjuk át. 65 7. példa 1,524 g BOC-Cys(TRI)-Gly-Glu-(OtBu), vegyületet és 508 mg jódot 25 ml metanolos közegben egy órán át szobahőmérsékleten reagáltatunk. A reakcióelegyhez 0°-on 70 In nátriumtioszulfát oldatot csepegtetve az oldat elszintelenítjük és a terméket 50 ml vizzel kicsapjuk. A megszárított nyers terméket háromszor 10-10 ml petroléterrel eldörzsöljük. A maradékot etilacetát-petroléter elegyből kikristályosítva 945 mg (91%) IBOC-Cys-Gly-Glu(OtBu), J2 keletkezik, 75 Op.: 150-152° Rf= 0,60 (kloroform-metanol (9:1) rendszerben). 8. példa 762 mg (1,0 mmól)BOC-Cys(TRI)-Gly-Glu(OtBu)2 és 634 mg (1,0 mmol) BOC-Cys(TRI)-Asn- OtBu reakcióját és feldolgozását a 7. példa szerint végezzük. A nyerstermék szilikagélen végzett vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat során kloroform-metanol (9.1) rendszerben három fpltot ad: Rf = 0,60 ([BOC-Cys-Gly-Glu(OtBu), ]2 (I) képlet; Rf=0,25 ([BOC-Cys-Asn-OtBul, U képlet és Rf = 0,45 (BOC-CVs-Asn-OtBu BOC-Cys-Gly-Glu(OtBu), (II!) képlet Az elválasztás ellenáramú megosztással történik, metanol-0,1 mólammóniumacetát-kloform-széntetraklond (4:2:1:3) rendszerrel. 100 részlet után a II képletű vegyület az 56-76 frakciókban van (rmax=65; K = 1,85). Ezeket összeöritjük, friss alsó fázissal töltünk fel és újabb 100 részletet engedünk át. A III kepletu vegyület mar a 8-25 csövekben megtalálható (rmax = 16; K = 0,09), az I képletű vegyület pedig a 0-5 frakcióban. Ezeket a frakciókat bepároljuk, az ammóniumacetátot elszublimáljuk és a három vegyületet a vékonyréteg kromatográfia szerinti tiszta alakban kapjuk: I: ctilacetát- petroléter elegyből átkristályosítva 150-152'on olvad; termelés 225 mg (számított 260 mg); ü: melanol-eter elegyből atkristáiyositva 194-196 -011 olvad; termelés 162 mg (számított 195 mg); III:termék amorf alakú, termelés 463 mg. Ha a reakciót 1 mmol BOC-Cys(TRI)-Gly-Glu(OtBu). és 2 mmol BOC-Cys(TRI)-Asn-OtBu vegyületekkel és 3 mmól jóddal végezzük, 580 mg III képletű termék keletkezik (számított 606 mg). 9. példa 254 mg (1 mmól) jód 5 ml jégecetes oldatához 380 mg (0,5 mmól) BÜC~Cys(TRI)-Gly-(OtBu), és 45 mg (0,55 mmól) vízmentes nátriumacetát 5 ml jégecetes oldatát adjuk és egy órán át keverjük. In nátriumtioszulfát (1.7 ml) hozzáadásával a barna oldatot elszintelenítjük: további 5 ml jégecetet adunk hozzá és liofilizáljuk. A keletkezett port vízben felvesszük, szűrjük és a maradékot jol kimossuk vizzel. Foszforpentoxid felett szárítjuk, és etilacetát-petroléter elegyből átkristályosítva 205 mg (80%) [BOC-Cys-Gly-Glu (OtBu)2 l 2 keletkezik. Op.: 151-152°. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás cisz tin tartalmú peptidek és származékaik előállítására ciszteinból, vagy ciszteintartalmú aminósavsorból, a risztéin, vagy a ciszteingyökök oxidálásával, azzal jellemezve, hogy oíyan ciszteint, vagy ciszteingyököt tartalmazó aminosavsort vagy aminosavsorokat, amelyekben a risztéin merkaptocsoportja tritilcsoporttal védett, jódot és az aminosavat, vagy a pepiidet és származékait legalább részben oldó oldószerben jóddal kezelünk. (Elsőbbsége: 1968. május 10.) 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a reakciót 0-60° közötti hőmérsékleten hajtjuk végre. (Elsőbbsége: 1968. május 10.) 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a reakciót szobahőmérsékleten hajtjuk végre. (Elsőbbség: 1968. május 10.) 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a reakciót egy rövidszénláncú alifás alkoholban végezzük. (Elsőbbsége: 1968. május 10.) 5. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a reakciót metanolban végezzük. (Elsőbbsége: 1968. május 10.) 6. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a reakciót jégecetben végezzük. (Elsőbbség: 1969. május 10.) 6
