161454. lajstromszámú szabadalom • Eljárás cisztintartalmú peptidek előállítására
161454 felvesszük és négyszer félig telített konyhasóoldattal mossuk. Az c'datot nátriumszulfát felett szárítjuk, kb. 15 ml bepároljuk és kb. 5 ml petrolétert adunk hozzá. Egy éjszaka alatt 3,17 g hidrazid kristályosodik ki. Op.: 132-134°. Szilikagéles vékonyrétegkromatográfiával toluol-aceton 6 (7:3) eleggyel Rf=0,40. 5) H- Val-Leu-OME,HCl 5,66 g (.15 mmól( Z-Val-Leu-OMe vegyületet 75 ml metanolban 15 mmól sósav és 850 mg Pd-szén (10%) 10 katalizátor jelenlétében szobahó'mérsékleten hidrogénezzünk. A hidrogénfelvétel 3 óra múlva leáll. A katalizátort Jeszűrjük és az oldatot kb. 15 ml-re bepároljuk. Éter hozzáadásával a termék kikristályosodik. Op.: 136-139° Szilikagéles vékonyrétegkromatográfiával kloroform- 15 metanol (9:1) rendszerrel Rf=0,45; toluol-aceton (1:1) rendszerrel Rf=0,43. 6) TRI-Cys(RI)- Val-Leu-OMe 7,13 g (10 mmól) TRl-Cys(TRI)-OH dietilaminsót 20 kloroformban 0°-on In citromsawal és félig telített konyhasooidattal mosunk, az oldatot szárítjuk, bepároljuk, és a • keletkezett habot 50 ml etilacetáttal fevesszük Fhhez 1.4 ml (10 mmól) trietilaminnal elegyített 3,22 g (10 mmól) H-Val-Leu-jOMe-hidroklorid 40 ml 0°-os etilacetátos ol- 25 datát adjuk, melybó'l a kivált trietilamin-hidrokloridot kiszűrjük. Ezután 0°-on 2,26 g (11 mmól) szárított diciklohexilkarbodiimidet adunk hozzá, 2,5 órán át 0°-on keverjük és egy éjszakán át hűtőszekrényben állni hagyjuk. A kivált diciklohexilkarbamidot leszűrjük és az oldatot 0°-on 1 n 30 citromsawal, 1 n nátriumbikarbonáttal és félig telített konyhasóoldattal mossuk, és nátriumszulfát felett szárítjuk. Az oldatot kb. 20 ml-re bepároljuk és a további diciklohexiikarbamidtól leszűrjük. Szárazra párolva 8,53 g észter keletkezik. Tisztítás céljából a nyersterméket egy szilikagél 36 oszlopon (5 x 55 cm) kromatografáljuk. 400 ml lefutása után a fó'terméket 300 ml petroléter-etilacetát (1:1) eleggyel tiszta alakban eluáljuk. Szilikagéles vékonyrétegkromatogramon kloroform-metanol (99:1) rendszerrel Rf = 0,43. 40 7) H- Cys- (TRI) - Val-Leu-OMe 11,08 g (13,3 mmól) TRI-Cys(TRI)-Val-Leu-OMe vegyületet 75 ml etilacetátban oldunk és 12,3 ml vizet « csepegtetünk hozzá úgy, hogy az oldat állandóan tiszta maradjon, Egy órás, szobahó'mérsékleten történő' keverés után a tiszta oldathoz 64 ml vizet adunk, a csapadékot leszűrjük és hideg 50%-os ecetsavval mossuk. A szűrletet nagy vákuumban 40°-on olajjá pároljuk be, ezt 250 ml. _„ etilacetátban felvesszük, és 0°-on In náíriumbikarbonát-oldattal és telített konyhasóoldattal mossuk. Nátriumszulfát felett szárítjuk, bepároljuk és így ",07 g fehér termék keletkezik. Szilikagélen végzett vékonyrétegkromatográfia során kloroform-metanol (98:2) rendszerrel futtatva, az „ anyag Reindel-Hoppereagenssel befújva 0,30 Rf értékű foltot mutat S) DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)- Val-Leu-Ome 13,6 g (23,8 mmól) DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-NH2 220 ml dirnetilformamidos oldatához-12°-on, 32,26 mletilacetátos sósavat (1,84-n; 59,25 mmól) és 3,26 ml (28,55 mmól) tercier-butilnitritet adunk. 15 perc múlva -10°-on 14,03 g (23,8 mmól) H-Cys(TRI)-Val-Leu-OMe és 8,315 ml (59,25 mmól) trietilamin 100 ml dirnetilformamidos, -10°-ra hűtött oldatát csepegtetjük hozzá úgy, hogy a rekacióhémérséklet g5 -9° fölé ne emelkedjen. Az elegyet további egy órán át -10°-on keverjük, majd egy éjszakán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk. A keletkezett trietilamin-hidrokloridot szűréssel eltávolítjuk, a szűrletet nagy vákuumban 40°-on bepároljuk, az olajos maradékot 500 ml etilacetátban fel- ,» vesszük, ín citromsawal, In nátriumbikarbonáttal és telített konyhasóoldattal mossuk, szárítjuk, kb. 40 ml-re bepároljuk és kb. 10 ml petrolétert adunk hozzá. Egy éjszaka alatt kikristályosodik a védett peptioészter. Op.: 177-178°. , Szilikagéles vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatban klo- 75 roform-metanol (98:2) rendszerrel futtatva Rf=0,45; toluolaceton (7:3) rendszerrel Rf=0,57. 9) DPC-ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)Val-Leu-OH 2,830 g (2 mmól) DPC-Ser(tBu>Thr(tBu)- Cys(TRI)-Val-leu-OMe vegyületet 60 ml 75%-os dioxánban oldunk és 3 ml 2n nátronlúgot (6 mmól) adunk hozzá. 1,5 órás szobahőmérsékleten történő állás után a dioxánt 40°-on vizsugárszivattyúval létesített vákuumban bepároljuk, etilacetátot és vizet adunk hozzá és 0°-on 1 n citromsawal a pH-t 3-ra állítjuk be. Az etilacetátos fázist konyhasóoldattal mossuk, szárítjuk és bepároljuk. Olyan termék keletkezik, amely vékonyrétegkromatográfiásan (szilikagélen) egységes. Rf érték kloroform-metanol (7:3) rendszerben 0.40; R1'4 5 - 0,55. 10) H-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)Val-Leu-OH 2,22 g (2 mmól) DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Val-Leu-OH vegyületet 20 ml metilénkloridban oldunk és 12 ml vizes klórecetsav-oldatot (75 g klórecetsav és 25 mlviz) adunk hozzá. A tiszta oldatot 15 percig szobahőmérsékleten keverjük, 0°-ra hűtjük, majd 70 ml vizet adunk hozzá. Koncentrált ammónioldattal pH=6,5-re állítjuk be, ekkor kiválik a termék. A vizes oldatot dekantáljuk és a maradékot háromszor vizzel eldörzsöljük, majd üofilizáljuk. A terméket háromszor éterrel eldörzsölve fehér por keletkezik, amely vékonyrétegkromatográfiásan egységes. Ebben az alakban a termék tovább használható. Szilikagéles vékonyrétegkromatogramon a termék Rf értékei: Rf,s =0,48; Rf, „, =0,65; Rf 5 , =0,75. 11) Z-Asn-Leu-OMe 16,7 g H-Leu-OMeés 46,0 g Z-Asn-ONP vegyületeket 100 ml frissen desztillált dimetilformamidban oldunk. Az oldatot 19 órán át 25°-on állni hagyjuk.1,2 liter vizet adunk hozzá és a kristályos csapadékot leszívatjuk. A dipeptidszármazékot 40°-on vákuumban szárítjuk, majd metanol-víz elegyből kétszer kikristályosítjuk. Op.: 180-181°;' {«IT?-«» •9° (c = 2,05, kloroformban). D 12) H-Asn-Leu-OMe 15 g Z-Asn-Leu-OMe végyüietfet«400 ml t-butanol-viz (9:1) elegyben oldunk és 2 g pAádium-szén (10% Pd) katalizátor jelenlétében hidrogénezünk. A hidiogénezés befejeztével a katalizátort leszivatj.uk és az '.oldatot 40°-on bepároljuk. A maradékot a továbbiakban közvetlenül felhasználhatjuk. 13) Z-Ser(tBu)-Asn-Leu-OMe 8,90 g H-Asn-Leu-OMe és 11,0 g Z-Ser(tBu)-OH vegyületet 100 ml frissen desztillált dimetilformamidban oldunk. Az oldatot 0°-ra hűtjük és 3,90 g N-hidroxiszukcinimidet, majd 8,70 g diciklohexilkarbodiimidet adunk hozzá. 30 perces 0°-on és 18 órás 25°-on történő állás után leszívatjuk a kivált diciklohexilkarbamidot és a szürletet 800 ml jeges vízre öntjük. Az így keletkezett kristályos csapadékot vákuumban 40°-on szárítjuk, majd metanol-viz elegyből átkristályosítjuk. Az analitikailag tiszta formában keletkezett 7-Ser(tBu)-Asn-LeU-OMe 202-205°-on olvad; [a] ^ = -18° (c = 1,05, jégecetben). 14) H-Ser(tBu)-Asn-Leu-OMe 6,3 g Z-Ser(tBu)-Asn-Leu-OMe vegyületet 600 ml metanolban oldunk, és 1,2 g palládium-szén (10% Pd) katalizátor ' jelenlétében hidrogénezzük. 1,25 óra múlva a katalizátort leszivatjuk és vákuumban 30° fürdőhőmérsékleten szárazra pároljuk. Az így keletkezett kristályos tripeptidszármazék szilikagéles vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat során kloroform-metanol (90:10) rendszerben RF=0,10 értéket mutat. 15) BOC-Cys(TRI) -Ser(tBu)-Asn-Leu-OMe 5,0 g H-Ser (tBu)-Asn-Leu-OMe és 6,7 g BOC-Cys(TRI) -ONP vegyületet 30 ml frissen desztillált dimetilformamidban oldunk. A sárga oldatot 42 órán át 26°-on állni hagyjuk. Ezután 500 ml jeges vizet hozzáadva kicsapjuk és a kivált
