161356. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antigén anyag és élő vírusvakcína előállítására a Marek-féle baromfibetegség vírusából
161356 11 12 c) Hogy a természetes fertőzés ellen védelmet nyújtó, lehető legjobb vakcinaadagot megtaláljuk, azonos típusú csirkék 20 egyedből álló csoportjait az attenuált Frant-törzs változó adagjaival oltottuk, majd úgy végeztük a ráfertőzést, hogy 20 olyan csirkével kevertük össze őket, amelyeket előzőleg a nem attenuált heveny HPRS törzs 100 plakk-képző egységnyi egyedi adagjaival fertőztünk, hogy így fertőzési forrásról gondoskodjunk számukra. Az összes csirkét 5 hónap múlva leöltük. A következő táblázatba foglalt adatok mutatják a Marek-féle betegség előfordulását az egyes csoportokban: Vakcinázva egyedenként 106 plakk-képző egység Kontakt-Kontroli vfrussal Adag plakk-képző egység egyedenként: Semmi (kontrol) is 103 10 2 10 > A csirkék száma 20 20 20 20 20 Elváltozásokat mutató csirkék száma 0 2 8 17 20 Nyilvánvaló, hogy az 1000 plakk-képző egységnyi egyedi adag megfelelő védelmet nyújtott az állomány más egyedeitől származó fertőzéssel szemben. Stabilitási vizsgálat Az attenuált Frant-törzset vizsgáltuk stabilitására olyan módon, hogy a patogenitás hiányára végzett kísérletek egyik „Sykes 50" vonalbeli csirkéjének a véréből izolált vírust Marek-féle vírustól mentes csirkevese szövettenyészeten szaporítottuk. A szövettenyésztési vizsgálatok igazolták, hogy a törzsben nincs ,,A"-antigén. A ,,Sykes 50" vonalhoz tartozó, az izolált törzzsel oltott 20 egynapos csirke legalább 6 hónapig klinikailag normális maradt, ami arra utalt, hogy a törzs nem alakult vissza a patogén formává. Onkogenitási vizsgálat Az általánosan elfogadott módszernek megfelelően hörcsögökön pofazacskópróbát végeztünk. A csirkeembrió fibroblaszt sejtekhez kötött attenuált vírussal oltott hörcsögök egyike sem mutatott tüneteket. Ezeket az eredményeket megerősítettük két csoport újszülött hörcsögön; ezek a kezelést követő 8. héten nem mutattak klinikai tüneteket. A vírus szóródására végzett vizsgálatok „Sykes 50" vonalhoz tartozó beoltott csirkék egy csoportját 4 hónapon át fogékony csirkékkel tartottuk érintkezésben. Mindkét csoportból kéthetenként vért vettünk, és vérsavójukat ellenanyagok és vakcinavírus jelenlétére vizsgáltuk. A vak cinázást követő 11. héten az összes csirkéből vért vettünk, és vérük fehérvérsejtüledékét vakcinavírus jelenlétére vizsgáltuk. A következő táblázat szemlélteti az észlelt eredményeket : 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 A csirkék száma 5 10 Ellenanyag kimutatása 10 hét múlva 4 hónap múlva mind pozitív mind negatív Vírusizolálás 3 0 Különféle heveny vírusokkal szembeni védettség vizsgálata Egyenként 18—18 egyedből álló, Marek-féle betegségtől mentes 3 barna Leghorn csirkecsoportot képeztünk. Az első csoportot az előbbiekben jelzett Frant-törzstől függetlenül izolált, nem attenuált „Frant 2" jelzésű heveny törzzsel oltottuk. Minden csirkét 500 plakk-képző egységnyi „Frant 2" vírussal oltottunk, és ezeket fogékony kontrollok (2. csoport) kontaktfertőzésére használtuk. A 3. csoportot az attenuált Frant-törzs 1000 plakk-képző egységével vakcináztuk. Az állatokból időnként vért vettünk, és vér savójukat a vakcinatörzzsel és a ráfertőző „Frant 2" törzzsel szemben ható ellenanyagok jelenlétére vizsgáltuk. A kísérlet kezdetét követő 8. hétig a két vizsgált vírustörzzsel szemben csak két vakcinázott csirkében találtunk ellenanyagokat, viszont 11 kontroll csirke közül nyolcban voltak ilyen ellenanyagok. A kísérlet azt is igazolta, hogy a nem attenuált vírustörzsek szabadon terjednek át a velük érintkező állatokra, mint ahogyan az a gyakorlati tapasztalatok alapján elvárható is volt. Vakcinatermelésre való alkalmassági vizsgálatok A Frant-törzs passzázsait vizsgáltuk mikoplazmák jelenlétére, és ilyen fertőzéstől mentesnek találtuk. Ezt követően a gyakorlatban több ezer csirkén kísérleteket végeztünk csirkeembrió fibroplaszt sejtekhez kötött attenuált Frant-törzset tartalmazó vakcinával. A vakcinát (0,2 ml, 10:i plakk-képző egységet) a csirkék combizomzatába fecskendeztük. Minden esetben az állományok felét oltottuk izomba 1000 plakk-képző egységnyi vakcinavírussal. Minden olyan esetben, amikor az állományok oltatlan egyedeiben Marek-féle betegség jelentkezett, a vakcinázottak egészségesek maradtak. 3. példa Kísérlet a HPRS 16 törzzsel Az 1. példa szerinti 15 passzázs után ezt a törzset sorozatosan tovább passzáltuk, éspedig 12 esetben csirkevesesejteken 1. tápfolyadékban, 12 esetben csirkeembrió fibroblaszt sejteken 3. tápfolyadékban és 12 esetben kacsaembrió fibroblaszt sejteken 3. tápfolyadékban. A törzset ezután megvizsgáltuk „Sykes 50" vonalhoz tartozó 10 naposcsirkén, amelyeket a vírus 103 plakkképző egységével oltottunk, és 6 hónapon át klinikai megfigyelés alatt tartottunk. Semminemű klinikai tünet nem mutatkozott, és amikor az összes állatot kórbonctani vizsgálatnak vetettük alá, bennük semminemű elváltozást nem tudtunk kimutatni. 6
