161356. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antigén anyag és élő vírusvakcína előállítására a Marek-féle baromfibetegség vírusából
161356 8 ni sődleges izolálási passzázsban a tenyészeteket 3 naponként végzett tápfolyádékcserékkel további 10—14 napig inkubáltuk. Víruspasszálás Amikor a vírus citopatikus hatása a sejtek- 8* ben jól kifejlődött, a sejteket 0,05% etilén diamintetraecetsavas tripszinoldattal végzett diszpergálással leoldottuk az edény felületéről, amelyen nőttek. A szuszpendált sejteket a tripszinetilén-diamintetraecetsavas oldatból kicentrifu- síP gáltük, tápfolyadékban újra szuszpendáltuk, és friss összefolyt egyrétegűi tenyészetek fertőzésére használtuk fel. Minthogy a vírus sejthez kötött volt, citopatikus hatása passzázsról-passzázsra csak lassan fokozódott. Ezért az első pasz- -45 százsokban a használt tenyészetes edények számát az egyes passzázsok között legfeljebb megduplázni lehetett, de későbbi passzázsok során "e tenyészetek számát a passzázsok között meg lehetett négyszerezni vagy nyolcszorozni. ^0 •'Az attenuált vírus tulajdonságai , A csirkeyese szövettenyészetekben folyamatosán passzált vírus 3—6 hónap alatt áttenuáló; dött- Az attenuált vírus citopatikus hatása olyan 25 mértékben fokozódott, hogy az egyes passzázsok közötti időközt 7 napról 3 napra lehetett csökkenteni. Az attenuált vírus egyrétegű csirkevese szövéttenyészetekben : 6—7 nap alatt 1,0—1,5 mm átmérőjű, szabad szemmel észlelhető plak- 30 kokat, elhalási gócokat képezett. Nagy fokban fertőzött tenyészetekben a már említett Ouchterlony-féle technika vagy géldiffúziós próba alkalmazásával nem tudtunk a tápfolyadékba kibocsátott antigént kimutatni, viszont nem atte- 35 nuált vírus esetében ilyen antigén kibocsátását észleltük. Hogy ennek az antigénnek a hiányát megbízható módon igazolhassuk, a fertőzött tenyészetek tápfolyadékát mintegy 1/50 részére kellett koncentrálni, vízzel való kivonással vagy 40 az antigének ammóniumszulfátos kicsapásával. Az attenuált vírus fogékony törzshöz (pl. HPRS—RIR törzshöz) tartozó egynapos csirkékben, fertőzött csirkevese sejtszuszpenzió alakjában ezek véráramába vagy hasüregébe fecskén- 45 dezve, nem okozott Marek-féle betegséget. Kísérleti vakcina termelése A 7,5% dimetilszulfoxidban folyékony nitrogén fagyasztóban fagyasztott fertőzött csirkévé- 50 se sejtek alakjában tárolt vírustörzsanyagot gyorsan felolvasztottuk, és összefolyóan benőtt egyrétegű csirkevese tenyészetek beoltására használtunk. Mintegy 103 plakképző egységnyi vírus elég volt egy-egy 50 mm átmérőjű Petri- 55 csésze fertőzésére. Ezeket a tenyészeteket azután alkalmas időközökben (pl. 3—6 naponként) passzáltuk, aszerint, hogy milyen hatékonysággal fejlődött ki bennük a citopatogén hatás-Minden fertőzött tenyészet sejtjeit 2—8 friss te- 60 nyészet fertőzésére használtuk fel, a citopatogén hatás fokától függően. A szükséges vakcina mennyiségétől függő 6—10 ilyen passzázs után az összegyűjtött fertőzött csirkevese sejtszuszpenziót ampullákba töltöttük, és 7,5% dimetil- (55 szulfoxidban, folyékony nitrogén fagyasztóban tároltuk. Az ampullák fertőzött sejttartalmának becslésére egyrétegű csirkevese szövettenyészetekben plakktitrálást végeztünk. Adagolás A tárolt vakcinát számítások alapján úgy hígítottuk, hogy minden oltandó csirke egyréteges szövettenyészeten körülbelül 5xl02 —7xl0 3 plakkot, elhalási gócot képző vírusadagot kapott. A hígításra 7,2 pH-ra pufferolt fiziológiás konyhasóoldat volt alkalmas. Alkalmazási mód A befecskendezést a hígítás után azonnal végrehajtottuk. A vakcinát hasüregbe (intraperitoneálisan) fecskendeztük be 0,2—1,0 ml, például 0,5 ml mennyiségben. Tömegtermelés A vírust nagy mennyiségben Roux-edényekben vagy Thompson-palackokban tenyésztett egyrétegű csirkevese szövéttenyészetekben szaporítottuk el. Egyrétegű szövettenyészetek előállítására Roux-edények oltására 100 ml tápfolyadékban 40xlOe frissen tripszinezett csirkevesesejtet, Thompson-palackok oltására pedig 200 ml tápfolyadékban 80xl06 sejtet használtunk. Ebben az esetben az előbbiekben megadott tenyésztő és fenntartó tápfolyadékokat használtuk, azzal az eltéréssel, hogy az Earl-féle pufferoldat helyett a Hanka-félét használtuk. A vírust megfelelő, általában 10-et meg nem haladó számú passzázson vezettük át, és akkor gyűjtöttük össze, amikor a kívánt vakcinamennyiséghez szükséges elegendő számú tenyészetben észleltünk a szövetréteg 10%-át meghaladó citopatikus hatást. A vakcina tárolása A fertőzött sejteket a tripszin és etiléndiamintetraecetsav keverékéből az előbbiekben leírtak szerint centrifugálással választottuk ki. A sejteket ezután 10% borjúszérumoÜ és 7,5% dimetilszulfoxidot tartalmazó tápfolyadékban újra szuszpendáltuk. A sejtkoncentrációt ml-kéntkb. 4xl06 sejtre állítottuk be, a sejtszuszpenziót ampullákba töltöttük, majd az ampullákat leforrasztottuk. Hűtéskor +4 és —40 C° között úgy szabályoztuk a hűtés ütemét, hogy a hőmérséklet percenként 1 C°-kal csökkenjen. —40 C° elérésekor az ampullákat gyorsan áthelyeztük a folyékony nitrogén fagyasztóba. Immunogenitási vizsgálatok csirkében Megállapítottuk, hogy a vakcina 500—7000 plakk-képző egysége egynapos vagy kéthetes csirkékbe fecskendezve nem okozott kedvezőtlen hatást 20 hetes megfigyelési idő alatt. A beoltást követő 3—4 hét után kontakt fertőzéssel végzett ráfertőzés során a beoltott állatokban stabil védettséget tapasztaltunk, a fertőzött kontrollokban viszont 50% vagy nagyobb volt a mortalitás. (Plakk-képző egységen azt a vírusmennyiséget értjük, amely egyréteges szövettenyészeten egy elhalási gócot képez.) Az egyes vakcina-sarzsok immunogenitásának rutinszerű ellenőrzésére 20 egynapos csirkét kell beoltani a vakcinával hasüregbe, és további 20 csirkét elkülönítve tartunk beoltatlan kontroll-4
