161252. lajstromszámú szabadalom • Eljárás csökkent allergén hatású penicillinek előállítására

161252 17 18 -2. táblázat Benzilpenicillin K-só, g Enzim 6-(D-a-azido-fenilacetamido)-penicillánsav Benzilpenicillin K-só, g példa gramm E/g 6-(D-a-azido-fenilacetamido)-penicillánsav Példa Benzilpenicillin K-só, g példa gramm E/g hozam g tisztaság . % hozam, % 16b 16c 16d I6e 16f 16g 16h 18i 16j 21 3 6,3 21 4a 4,2 21 5 5,4 21 7a 145 21 7b 6 21 7c 0,1 21 9b 5,4 21 10 2,4 21 9a 0,9 1600 2920 2340 87' 1890 128000 2400 6000 14000 18,9 18,0 16,2 20,4 19,7 18,5 20,5 18,5 20,0 95,8 94,0 89,7 95,8 96,6 96,0 92,7 95,5 91,4 81 76 65 87 86 79 85 79 82 17. példa Benzilpenicillin enzimes szintézise 175 mg 6-aminopenicillánsavat és 111 mg fenilecetsavat feloldottunk 10 ml káliumfoszfátpufferoldatban 7,0 pH-nál. A 7c példa szerint előállított 128 000 E/g aktivitású acilázból 3,6 mg-ot feloldottunk 5 ml vízben, és az oldatot hozzáadtuk az előbbi oldathoz. Az oldat pH-ját 1 mólos foszforsavval 5,0-ra állítottuk be, és 37 C°-on inkubáltuk. A pH-t 5,0 értéken tartottuk, és 4 óra elmúltával az oldatot lehűtöttük, és papírkromatográfiai úton megelemeztük. A 6--aminopenicillánsav 30%-a átalakult benzilpenícillinné. 18. példa Antigén-hatás próbák Módszer: passzív bőrérzékenység vizsgálata tengerimalacokon Weck és munkatársai módszerével [Int. Arch. Allergy 33. 535—567 (1968)]. Házinyúl 6-aminopenicillánsav^antiszérumot készítettünk nyers 6-APS ismételt szubkután befecskendezésével és dializált 6-APS ugyanilyen módon való kétszeri befecskendezésével. Passzív hemagglutinációs próbákban ennek az antiszérumnak a titere 1/4096 volt. Ebből a 6-APS antiszérumból 1 ml-t intravénásán befecskendeztünk egy fehér tengerimalacba. 24 óra elmúltával intravénásán befecskendeztünk 0,1 ml 5%-os fiziológiás sóoldatos Evans-kék •oldatot, majd egy óra elmúltával intradermálisan beadtunk 0,1 ml oldatot, amely 4 mg, a 14d, 14g, illetve 14i példák szerint készült 6-aminopenicillánsavat tartalmazott. Az állat hátának egy negyedik pontjára a szokásos módon E. coli teljes sejtjeinek felhasználásával készült 6-APS injekciót adtunk. A 6-APS injekciókat közvetlenül feloldódás után alkalmaztuk. Kontroliképpen 0,1 ml fiziológiás sóoldatot fecskendeztünk be intradermálisan. Egy második tengerimalaccal megismételtük ugyanezt a kezelést, azzal a különbséggel, hogy a 6-APS antiszérumot intravénásán befecskendezett 1 ml fiziológiás sóoldattal helyettesítettük. Az intradermális injekciók után 2 órával meghatároztuk az injekciós helyek kék színeződését, és 20 25 30 35 kifejeztük egymásra merőleges két átmérő szorzataként. Eredmények: A 6-APS injekciók mind a nem érzékenyített, mind a passzívan érzékenyített állatban a színezék szétterülését okozták, és ez nagyobb mértékű volt, mint a fiziológiás sóoldat befecskendezésének helyén. Azonban, mint a 3. táblázatból kitűnik, a szokványos 6-APS injekció erősebb reakciót váltott ki az érzékenyített állatban. Ugyanezt eredményezi, bár sokkal kisebb mértékben a találmány szerinti eljárással kapott 6-APS. 3. táblázat 4 mg intradermálisan befecskendezett 6-APS okozta kék foltok 2 egymásra merőlegesen mért átmérőjének (mm2

) szorzatai. 6-APS készítmény 40 Példa sorszáma 45 50 55 60 ^ , Nem érzé-Érzekenyi- kenyített tett állat állat Különbség E. coli sejtekkel készült készítmény 256 110 146 14d 132 120 22 14g 195 169 26 14i 156 169 —13 Fiziológiás sóoldat 12 12 — Az eredményekből kitűnik, hogy a szokváT nyos módszerekkel készült 6-APS készítmény különbözik a többi 6-APS készítménytől a passzív bőrérzékenységi reakciót kiváltó képesség tekintetében. Ez kifejezi a találmány szerinti eljárással készült 6-APS csökkent antigén hatását a szokványos eljárásokkal, teljes E. coli sejtekkel készült 6-APS-sel összehasonlítva. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás csökkent allergen hatású penicillinek előállítására természetes penicillineknek Esche-05 richia coli tenyésztésével kapott sejtmentes pe-9