161252. lajstromszámú szabadalom • Eljárás csökkent allergén hatású penicillinek előállítására

7 161252 8 2. példa E. coli baktériu-,dsejtek előállítása 3 kg kukoricalekvárt, 135 ml- szójababolajat, 12 ml paraffinolajtat és 3 ml ecetanolt elkevertünk 150 ml vízben, és a keverék pH-ját 165 ml 45°/o-os nátronluggal 6,0 pH-ra állítottuk be, majd fermentorban 124 C°-on 30 percig sterilizáltuk. Az oldatot beoltottuk 100 ml 20—24 órás E. coli .(Astra 1339) tenyészettel, és levegőztetés és keverés közben 25 C°-on 18 óra hosszat inkubáltuk. 300 kg kukoricalekvárt, 13,8 kg szójababolajat, 1,22 kg paraffinolajat, 0,3 kg cetanolt, 21 kg fenilecetsavat és 112 kg nátriumkloridot elkevertünk 14 000 liter vízben, és a keverék pH-ját 40 kg 45%-os nátronlúggal beállítottuk 6,6 értékre, majd fermentorban 124 C°-on 30 percig sterilizáltuk. Az oldatot lehűtöttük, beoltottuk a fent ismertetett tenyészettel, majd keverés és levegőztetés közben 25 C°-on inkubáltuk. A beoltás után 24 órával, amikor a pH 8,2 értékre nőtt, a baktériumsejteket megöltük 180 liter butilacetát hozzáadásával, és a keveréket lehűtöttük. 2. példa Aciláz elkülönítése és tisztítása a) A baktériumtömeg elkülönítésére a keveréket egy öntisztító centrifugális szeparátorban (De Laval, BRPX 213—35S típusú) elválasztottuk. A baktériumsejt-pépet 100—120 kg-os adagokra osztottuk. Mindegyik adaghoz hozzáadtunk 3,0% metilizobutilketont, majd a keveréket egy Ultra Turrax keverővel (T 110/2M típus; ÍD percig homogenizáltuk. A kapott baktériumtömeg súlya összesen 325 kg volt. Az enzimet előállítása különböző lépéseiben megelemezve a következő adatokat kaptuk aciláz egységekben kifejezve az illető lépés során visszamaradó enzim mennyiségére (egy aciláz egység megfelel annak az enzimmennyiségnek, amely 1,5 óra alatt 8,5 pH-nál és 37 C°-on 1 mg 6-aminopenicillánsavval egyenértékű benzilpenicillint képes hasítani): termelő fermentációs tenyészet 5 E/ml folyadékfázis 0,33 E/ml centrifugális szeparátorból távozó folyadék 0,28 E/ml baktériumsejt-pép 212 E/g a pép feletti folyadék, homogenizálás előtt 75 E/g a pép feletti folyadék, homogenizálás után 123 E/g b) A 2a példában kapott baktériumsejt-pépet használtuk fel enzimszolubilizálási kísérletre. 100 g sejtpéphez 100 ml ionmentesített vizet adtunk. Az így kapott szuszpenzió pH-ja 5,9 volt; ezzel a következő kísérletsorozatot végeztük: 1. A szuszpenziót 5000 G-vel (centrifugális erő a gravitáció többszörösében mérve) centrifugáltuk 20 percig és meghatároztuk a folyadékfázis enzimatikus aktivitását. 2. A szuszpenziót Ultra Turrax keverővel 5 percig homogenizáltuk. A kezelés közben a 5 mintát jégfürdőben hűtöttük, nehogy hőmérséklete 35 C° fölé emelkedjék. Ezután az előző 1. pontban leírt módon centrifugáltuk, és a folyadékfázis aktivitását meghatároztuk. 3. A szuszpenzió pH-ját nátronlúggal keverés 10 közben 8,5-re állítottuk be, majd a mintát homogenizáltuk és centrifugáltuk a fent leírt módon, és meghatároztuk a folyadékfázis aktivitását. 4. A szuszpenzióhoz 3% metilizobutilketont 15 adtunk, és pH-ját a 3. pontban leírt módon beállítottuk. Ezután a mintát homogenizáltuk és centrifugáltuk a fent leírt módon, és meghatároztuk^ a folyadékfázis enzimatikus aktivitását. A szolubilizálási műveletet a következő táb-20 lázat szemlélteti: 25 40 45 Az Vg egész %-a .06 100 29 28 62 59 73 69 83 78 Baktérium szuszpenzió 1. folyadékfázis 2. folyadékfázis 3. folyadékfázis 4. folyadékfázis 30 c) 175 kg 190 E/g aktivitású homogenizált baktériumpépet 175 kg vízzel hígítottunk, és a keverékhez keverés közben hozzáadtunk 22,7 kg Hyflo-t, 22,7 kg Celite 505-öt és 10,2 kg Fibraflo-t. A vizes fázist Funda szűrőn át való szű-35 réssel elkülönítettük, és a szűrőlepényt 50 ml vízzel mostuk. A 290 kg egyesített oldat aktivitása 48 E/g volt. d) Egy kg 212 E/g aktivitású homogenizált baktériumpépet 2,0 liter vízzel hígítottunk, és a keverék pH-ját 220 ml 0,5 n nátriumhidroxiddal 8,5 értékre állítottuk be, majd 20 C°-on 30 percig kevertük. Ezután a keveréket 13 200 G-vel 30 percig 0 C°-on centrifugáltuk (Serwall, RC—2 típus, automatikus hűtött szupercentrifuga). A folyadékfázist dekantáltuk, és szűréssel derítve 2,7 kg oldatot kaptunk 50 E/g aktivitással. Az üledéket 1 liter vízben 2 ízben 8,5 pH-nál 5 percig szuszpendálva, majd centrifugálva 2 kg további enzimoldatot kaptunk 11 50 E/g aktivitással. Ez megfelel összesen 74% vízben oldható aciláz aktivitás hozamnak. e) A 2d példa szerint kapott 2 kg 50 E/g aktivitású víztiszta acilázoldatot liofilizálva 98,5 g szilárd acilázt kaptunk 950 E/g aktivitással. 55 f) A 2d példa szerint kapott 2 kg 50 E/ml aktivitású víztiszta acilázoldatot porlasztva szárítva 92 g szilárd acilázt kaptunk 920 E/g aktivitással. g) A 2d példa szerint kapott 1 kg 52 E/ml 60 aktivitású víztiszta acilázoldatot folyó csapvízzel szemben 8 óra hosszat dializáltunk. A dializáit oldatot liofilizálva 20,5 g szilárd acilázt kaptunk 2400 E/g aktivitással. h) A 2c példa szerint kapott 245 kg 48 E/g 65 aktivitású tiszta acilázoldatot keverés közben 4