161251. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sejtmentes penicillinaciláz előállítására

15 161251 16 benzilpenicillint káliumsó alakjában, 325 ml vízben oldva. Az oldatot 37 C°-on inkubáltuk, és a pH értékét időnként 2,5 n nátronlúgot hozzáadva 7,8-on tartottuk. Hat óra elmúltával az oldatot 10 C°-ra hűtöttük, és 2 pH-nál 200 ml metilizobutilketonnal extraháltuk a visszamaradt benzilpenicillin és a 6-aminopenicillánsav képződése közben lehasadt fenilecetsav-oldallánc eltávolítására. Az extrahálás után a vizes oldatot elválasztottuk a metilizobutilketonos oldattól. A vizes oldat pH értékét beállítottuk 7,5-re, és térfogatát vákuumban 110 ml-re csökkentettük. A tömény oldatot 5 C°-ra hűtöttük, és 10 megszűrtük. A szűrt oldatot 5 n sósavval 4,3 pH-ra megsavanyítva a kristályos 6-aminopenicillánsav kivált. A kristályokat szűrőre vittük, 2 ízben 5 ml hideg vízzel, majd 2 ízben 5 ml száraz acetonnal mostuk, és vákuumban megszárítva 8,51 g 6-aminopenicillánsavat kaptunk. A termék 99% tisztaságú volt, és az összes hozam benzilpenicillinre számítva 69%. Analóg módon állítottunk elő 6-aminopenicillánsayat az előző példák szerint készült enzimkészítmények felhasználásával. A hozamokat és a kapott sav tisztaságát az 1. táblázatban közöljük. 1. táblázat Benzilpenicillin K-só, g Enzim 6-^aminopenicillánsav Példa Benzilpenicillin K-só, g példa gramm E/g hozam g tisztaság % hozam, % 14b 21 3 6,3 1600 10,1 98,2 82 14c 21 4a 4,2 2920 9,8 96,0 78 14d 500 4b 450 800 261,3 98,5 89 14e 21 5 5,4 2340 7,55 97,0 60 14f 21 7a 145 87 9,9 100 81 14g 2100 7b 780 1610 1064 100 88 14h 21 7c 0,1 128000 9,3 98,0 75 14i 21 7d 0,11 116500 10,35 100 85 14j 21 9b 5,4 2400 9,1 100 75 14k 21 10 2,4 6000 8,82 100 72 141 21 9a 0,9 14000 9,23 100 76 15. példa 6-Aminopenicülánsav-p-nitrobenzilészter előállítása A 7b példa szerint kapott, 1610 E/g aktivitású enzimoldatból 18,6 g-ot 700 ml vízzel és 120 ml metanollal hígítottunk, és 0,1 mólos nátronlúggal 7,8 pH-ra állítottuk be. Hozzáadtuk 3,1 g (6,6 mól) p-nitrobenzil-benzilpenicillinátnak 60 ml metanollal készült oldatát. A keveréket 37 C°-on kevertük, miközben a pH értékét 0,1 mólos nátronlúg hozzáadásával 7,8-on tartottuk. 2,5 óra múlva a keveréket lehűtöttük, és 500 ml etilacetáttal extraháltuk. A savas réteget elkülönítettük, és további 250 ml etilacetáttal extraháltuk. A szerves rétegeket egyesítettük, és vízmentes nátriumszulfát fölött 1 óra hoszkét egyenlő részre osztottuk. Az egyiket szobaszat szárítottuk. A szűrés után a szerves oldatot hőmérsékleten vákuumban beparolva 1,1 g szabad 6-aminopenicillánsav-p-nitrobenzilésztert kaptunk olajos maradék alakjában. A termék infravörös színképe 3250, 1756 és 1720 cm-1 hullámszámnál mutatott sávokat, ami —NH2-csoport, /?-laktámgyűrű és észtercsoport jelenlétére mutat. 20 ml acetonban oldott 0,58 g benzolszulfonsavat hozzáadtunk az etilacetátos oldat másik részéhez, majd vákuumban kb. 30 ml térfogatra koncentráltuk az oldatot. 10 ml éter hozzáadása és éjjelen át hűtőszekrényben való állás •után 0,8 g p-nitrobenzil-6-aminopenicillinát-benzolszulfonsav-só vált ki fehér kristályok alakjában 148—151 C° olvadásponttal. 35 16. példa 6-(D-a-Azido-fenilacetamido)-penicillánsav elő-40 állítása 283 g 42 E/g aktivitású enzimoldathoz hozzáadtuk 20 g benzilpenicillin káliumsójának 317 ml vízzel készült oldatát. 45 A keveréket 37 C°-on inkubáltuk, miközben 2,5 n nátronlugnak időnkénti hozzáadásával a pH értéket 7,8-on tartottuk. Hat óra elmultával a 10,7 g 92%-os 6-aminopenicillánsavat tartalmazó reakciókeveréket megszűrtük. 50 Az oldatot 5 C°-ra hűtöttük, és 10 n kénsav hozzáadásával 3,0 pH-ra megsavanyítottuk. Ezután keverés közben hozzáadtunk 62 mmól D-a-azido-fenilacetilkloridot tartalmazó 300 ml metilizobutilketont. A keverést 30 percig foly-55 tattuk, és a pH értéket 2,5 n nátronlúg időnkénti hozzáadásával 3,0-n tartottuk. A reakciókeveréket átszűrtük 10 g Celite 505-ön, és a metilizobutilketonos oldatot elválasztottuk a vizes fázistól. A metilizobutilketonos oldatot 25 g 60 vízmentes nátriumszulfát fölött megszárítottuk. Szűrés ufián 41 ml metilizobutilketonos 2 n 2--etilkapronsavas nátrium oldat hozzáadásával a 6-(D-a-<azido-fenilacetamido)-penicillánsavat nátriumsója alakjában kiválasztottuk. A 6-(D-65 -ff-azido.-fenilacetamido)-penicillánsavas nátriu-K