161251. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sejtmentes penicillinaciláz előállítására

11 161251 12 hőmérséklete 110—115 C°, a kilépő levegő hőmérséklete 70—75 C° volt. Hozam 85 g, aktivitás 38Ó E/g. b) Lelbegtetéses szárítás 100 g cellulózport a 4b példa szerint készült 200 g 162 E/g aktivitású acilázoldattal kevertünk. A keveréket levegőáramban 40 C°-on 90 perc alatt lebegtetve megszárítottuk. 93,2 g száraz port kaptunk 284 E/g aktivitással. 7. példa Az aciláz tisztítása ioncserélő kromatográfiával a) A 2c példa szerint kapott 5000 ml 48 E/ml aktivitású acilázoldatot 9 mólos ecetsavval 4,6 pH-ra állítottunk be. Éjjelen át hidegben való állás után a keveréket leszűrtük, és a víztiszta oldatot átbocsátottuk egy 8 cm átmérőjű, 15 cm hosszú szulfoetil-Sephadex C 50 ioncserélő oszlopon. Az oszlopot 650 ml 4,6 pH értékű 0,1 mólos ammóniumacetát pufferral mostuk. Az acilázt 8,0 pH értékű 0,2 mólos ammóniumacetát pufferral eluáltuk. A kapott 640 ml oldat aktivitása 326 E/ml volt. b) A 4b példa szerint kapott 5500 ml 800 E/ml aktivitású tisztított acilázoldatot beállítottunk 4,6 pH-ra, és a 7a példában leírt módon kezeltük. 2350 ml oldatot kaptunk 1610 E/ml aktivitással. c) A 7b példa szerinti, SE-Sephadex-szel tisztított 250 ml 1610 E/ml aktivitású acilázoldatot —40 C°-ra hűtöttünk, és 25 C°-on 0,1—0,2 torr nyomás alatt megszárítottuk. 2,11 g tisztított acilázt kaptunk 190 000 E/g aktivitással. d) A 7b példa szerinti, tisztított 230 ml 1610 E/ml aktivitású acilázoldatot vákuumban 24 ml térfogatra koncentráltunk. Ebből a koncentrátumból 15 ml-t 15 000 E/ml aktivitással 2,5 cm átmérőjű és 100 cm hosszú Sephadex G75 oszlopon kromatograf altunk. Az acilázt ionmentesített, vízzel eluáltuk. 108 ml acilázoldatot kaptunk 1710 E/ml aktivitással. Ezt az oldatot liofilizálva 1,8 g száraz acilázt kaptunk 92 500 E/g aktivitással. e) A 7a példa szerint szulfoetil-Sephadex G50 oszlopon kapott 72 mg liofilizált acilázkészítményt feloldottunk 2,7 ml 6,30 pH értékű 0,005 mólos nátriumfoszfát pufferban, dializáltük ugyanezzel a pufferral szemben, majd egy 13,5 cm hosszú, 0,9 cm átmérőjű, előzőleg a pufferral egyensúlyba hozott, 1 milliekvivaléris/g kapacitású Whatman CM—32 karboximetilcellűlóz oszlopon kromatografáltuk. Az oszlopot a következő pufferoldatokkal eluáltuk: 0,005 mólos r^átriumfoszfát puffer, pH 6,3 (kb. 17 ml); 0,02 mólos nátriumfoszfát puffer, pH 6,35 (kb. 17 ml) és 0,1 mólos nátriumfoszfát puffer, pH 6,35. 1,3 ml-es részlegeket gyűjtöttünk, és a kioldást 280 m/^-nál mértük. Az- összes enzim aktivitás a 0,1 mólos pufferral eluálódott, és az eredeti fehérjetartalomnak csak 10%-át tartalmazta. Az összes kioltás 90%-a hatástalan fehérje volt a 0,005 mólos puff eres részlegekben. f) A 2h példa szerint kapott 100 ml oldatot desztillált vízzel szemben, majd 24,5 óra hosszat 6,0 pH értékű 0,005 mólos foszfátpufferral szemben dializáltuk. Az oldathoz hozzáadtunk 12,5 mg/ml ugyanazzal a pufferral egyensúlyba hozott 1,0 milliekvi valens/g kapacitású Whatman DE—32 dietilamiíioetilcellulózt. Az ioncserélő cellulózt 30 perc után elválasztottuk. Az acilázaktivitás növekedése nem volt észlelhető, de a kioltás 280 rnw-nál csak 10%-a volt az előző értéknek. Ezután az enzimaktivitást Whatman CM—32 karboximetilcellulózon adszorbeáltattuk, sósavval kezeltük, és egyensúlyig mostuk 5,5 pH értékű 0,005 mólos nátriumacetáttal. A két esetben különböző mennyiségű, 12,5 mg, illetve 3,2 mg/ml ioncserélőt használtunk. Az ioncserélő elválasztása után az ioncserélőt vízben diszpergáltuk, és a pH-t 6—7 értékre növelve 0,1 mólos foszfátpuffer hozzáadásával eluáltuk. A hozam kb. 80% volt. g) A 2h példa szerint kapott 100 ml oldatot desztillált vízzel, majd 22 óra hosszat 6,0 pH értékű 0,005 mólos foszfátpufferral dializáltunk. Az oldatot 2 ízben ugyanazzal a pufferral egyensúlyba hozott 12,4 mg/ml Whatman DE— 32 dietilaminoetilcellulózzal kezeltük. Ezután az oldatot 13 mg/ml ugyanolyan, de hidroxilfázisú ioncserélővel kezeltük az aciláz aktivitásának csökkenése nélkül. Az ioncserélőt 30 perc után elválasztottuk. A pH-érték 8,31-re nőtt. Ezután az enzimet 50 mg/ml hidroxilfázisú ioncserélő hozzáadásával teljesen adszorbeáltattuk. A pH 9,11 volt. Az ioncserélő elválasztása és vízben való diszpergálása után az enzimet a pH-nak kb. 6 értékre való beállításával eluáltuk. A hozam meghaladta a 60%-ot, és az enzim tisztasága az aktivitás és a 280 m/í-nál mért kioltás viszonya alapján számítva 20-szorosára növekedett., h) A 2c példa szerint kapott 100 ml oldatot desztillált vízzel szemben 1 óra hosszat dializálva sótalanítottunk, majd kb. 40 mg/ml 1 milliekvivalens/g kapacitású, H+ fázisú Whatman CM—32 karboximetilcellulózzal kezeltünk. Az oldat pH értékét 4,0 és 4,5 között tartottuk. Ezután az ioncserélőt elválasztottuk, és foszfátpuffer hozzáadásával a pH-értéket kb. 6-ra beállítva és az iontartalmat megnövelve az adszorbeált acilázt eluáltuk. i) Kiindulási anyagként a 2h példa szerint kapott oldatot alkalmazva megismételtük a 7h példa szerinti műveletet. j) A 2c példa szerint kapott 100 ml oldatot kb. 25 mg/ml H+ fázisú Whatman CM—32 karboximetilcellulózzal, majd ugyanannyi OH-fázisú Whatman DE—32 dietilaminoetilcellulózzal részben sótalanítottunk és fehérjementesítettünk. A pH értéket 5 és 7 között tartottuk. (A kezelés megismételhető, de be kell fejezni, mielőtt számottevő aciláz adszorbeálódnék.) Az enzimet ezután karboximetilcellulózon adszorbeáltattuk, és a 7h példában leírt módon eluáltuk. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6