161173. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inzulin-származékok előállítására
1611 9 képződött trisz-NA1 , N B1 , N * B29 -(metil-5-oxo-4-hexén-2-il-2)- [N ő-(dimetil-4,6-pirimidinil-2)ornitin B22]-inzulint liofilizálással elválasztjuk. Az [N (3-(dimetil-4,6-pirimidinil-2)-ornitinB22]inzulin sóit pH = 6 értéken kondenzáltatjuk cik- 5 lohexán-l,3-dionnal, ugyanis a reakció pH = 6 értéken sokkal gyorsabban zajlik le, mint pH = 8-on. A kiindulási sót — pl. [N <5-(dimetil-4,6-pirimidilin-2)-ornitin B22] -inzulin-hidrokloridot vizes káliumhidrogénkarbonát-oldat, ciklohexán- 10 xl,3-dion és etanol pP = 6 értékű elegyében oldjuk, és az elegyet 5 napon át 25 C°-on keverjük. A képződött trisz-NA1 , W31 , N EB 29-( 0 xo-3-ciklohexén—il-1)- [N d-(dimetil-4,6-pirimidinil-2)-ornitin B22]-inzulin kiválik a reakcióelegyből. A 15 kivált terméket centrifugálással különítjük el. A pirimidinil-inzulin-vegyületek és az X—CO— CH2— CO—Y általános képletű /?-diketonok kondenzációját általában pH = 5,5—8,5 értéken hajtjuk végre. Az izoelektromos pontnál kisebb 20 pH-értékeken az oxoenamino-csoportok nem stabilak, míg túl nagy pH-értéken a fehérje irreverzibilis változást szenvedhet. A kondenzáció során a reakcióközegtől függően az (V) általános képletű vegyület többé-ke- 25 vésbé asszociált molekula-aggregátumok formájában képződik. Ha az (V) általános képletű vegyületeket alkálifémhidroxid jelenlétében, pH~8 értéken fenollal vagy helyettesített fenolszármazékkal kezeljük, vízben oldódó, disszociált (IB) 30 általános képletű alkálifém-sókat kapunk, ahol X és Y jelentése nem azonos Z és R jelentésével. A fenolos kezelést a (III) általános képletű vegyületek disszociációjánál ismertetett körülmények között hajtjuk végre. 35 Az (IB), ill. (IA) általános képletű alkálifémsókat kívánt esetben önmagában ismert módon a szabad fehérjékké, vagy egyéb szerves vagy szervetlen bázissal képezett, vízben oldódó sókká alakíthatjuk. 40 Az (IA) vagy (IB) általános képletű vegyületeket pl. a következőképpen alakíthatjuk a megfelelő, disszociált szabad fehérjékké: a szabad fehérjét az izoelektromos ponton (pH~5,2) kicsap^ juk, vákuumban leszűrjük vagy centrifugálással 45 elkülönítjük, és a kapott terméket szárítjuk. Az így kapott szabad fehérjéket kívánt esetben vízben szuszpendáljuk, a szuszpenzióhoz szerves vagy szervetlen bázist adunk, majd a kapott, vízben oldható sót szerves oldószerrel, pl. aceton- 50 nal kicsapjuk. Az (IB) általános képletű, disszociált vagy gyengén asszociált sók feltehetően az (IA) általános képletű vegyületekhez hasonlóan néhány molekulából álló asszociátumokat képeznek, vagy a 55 termékek nem-asszociált, szabad molekulákból állnak. Az (IA) vagy (IB) általános képletű vegyületeknek megfelelő szabad fehérjék hasonlóképpen feltehetően gyengén asszociált molekulaaggregátumokat képeznek, az aggregátumok 60 azonban valószínűleg az (IA), ill. (IB) általános képletű sók aggregátumainál több molekulából épülnek fel. Az (I) általános képletű sóknak megfelelő szabad fehérjék asszociációja azonban lényegesen gyengébb a (III) általános képletű ve- 65 10 gyületeknél, ugyanis az (I) általános képletnek megfelelő szabad fehérjék vizes közegben, alkálifémsók formájában a természetes inzulinhoz hasonlóan igen könnyen szolubilizálhatók, míg a (III) általános képletű vegyületek kizárólag pH = 10 értéknél lúgosabb közegben szolubilizálhatók. Az (IA), ill. (IB) általános képletű vegyületek, valamint a megfelelő szabad fehérjék asszociációjára vonatkozó elméleti fejtegetéseink nem korlátozzák a találmány oltalmi körét. Amint már korábban közöltük, az (I) általános képlet egyaránt magában foglalja az (IB) általános képletű heteroszubsztituált vegyületeket (azaz ahol X és Z, ill. Y és R különböző csoportot jelent) és az (IA) általános képletű homoszubsztituált vegyületeket (azaz ahol X és Z, ill. Y és R azonos csoportot jelent), ugyanis az (I) általános képletben X és Z, ill. Y és R azonos vagy eltérő csoportokat jelenthetnek. Az (IA) és (IB) általános képletű vegyületeket a leírásban csak az egyértelműség és áttekinthetőség kedvéért különböztettük meg egymástól. A találmány szerinti eljárást továbbá úgy is végrehajthatjuk, hogy az erősen asszociált molekula-aggregátumok formájában jelenlevő (III) általános képletű alkálifémsókat fenol vagy helyettesített fenolszármazék jelenlétében, vizes oldatban savval reagáltatjuk. A reakció során közvetlenül (IV) általános képletű, vízben oldódó, diszszociált vagy gyengén asszociált sókat kapunk. A fenti eljárásban a fenol vagy a helyettesített fenol-származékok lehetővé teszik az erősen aszszociált (III) általános képletű vegyületek disszociációját, és ugyanakkor a képződött, vízben oldódó vegyületek oxo-enamino-csoportjainak hidrolízise is végbemegy. A fenti reakció tehát lényegében azonos a korábban ismertetett folyamattal, azzal a különbséggel, hogy a (IV) általános képletű vegyületet az (IA) általános képletű közbenső termék elkülönítése nélkül állítjuk elő. A reakciót rendszerint 75:25 arányú fenol :0,1 n vizes sósavoldat elegyében hajtjuk végre, majd a képződött (IV) általános képletű sót szerves oldószerrel, pl. acetonnal kicsapjuk. A fenti eljárással pl. az erősen asszociált molekulaaggregátumokat alkotó, vízben oldhatatlan trisz-N^1, N«1 , N£ « 29 -(oxo-4-pentén-2-il-2)-[N Ő-(dimetil-4,6--pirimidinil-2)-ornitin B22] -inzulin-káliumsót vízben oldódó, disszociált vagy gyengén asszociált [Nó-(dimetil-4,6-pirimidinil-2)-ornitin B22] -inzulin-hidrokloriddá alakíthatjuk. A reakcióelegyet 3 órán át 20—25 C°-on keverjük. Az inzulin és Z—CO—CH2—CO—:R általános képletű /?-diketonok homogén közegben végrehajtott kondenzációjával előállított (IA) általános képletű termékek kromatográfiás elemzéssel kimutatható kis mennyiségű szennyezést tartalmaznak. A papírkromatográfiás vizsgálatot butanol, ecetsav és víz 4:1:5 arányú elegyével végezzük, az alsó fázist impregnáljuk és brónifenolkékkel hívjuk elő. A kimutatható szennyezések a vízben oldódó, disszociált (IA) általános képletű vegyületeknél sokkal kevésbé mozgékonyak. A szennyezőanyagok valószínűleg irreverzibilisen denaturálódott fehérjékből állnak. 5
