161173. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inzulin-származékok előállítására
161173 ket kívánt esetben savas hidrolízisnek vetjük alá, majd a képződött, (IV) általános képletű, vízben oldódó disszociált vagy gyengén asszociált vegyületet — ahol Z és R jelentése a íent megadott — X—CO—CH2— CO—Y általános képletű — /?-diketonnal reagáltatjuk — ahol X és Y jelentése a fent megadott. A reakció során többé-kevésbé erősen asszociált (V) általános képletű vegyületet kapunk — ahol X, Y, Z és R jelentése a fent megadott. Az (V) általános képletű vegyület a reakcióközegben, ill. az elkülönítés során uralkodó pH-értéktől függően szabad fehérje vagy só lehet. Az (V) általános képletű vegyületet a következő lépésben alkálifémhidroxid jelenlétében, pH~8 értéken fenollal vagy helyettesített fenol-származékkal kezeljük. A reakció során disszociált vagy gyengén asszociált, vízben oldódó (IB) általános képletű vegyületet kapunk a megfelelő alkálifémsó formájában — ahol X, Y, Z és R jelentése a fent megadott. A fenti módon előállított (IA) vagy (IB) általános képletű vegyületet kívánt esetben ismert módon a megfelelő szabad fehérjévé, vagy más, szerves vagy szervetlen bázissal képzett sóvá alakíthatjuk át. A találmány szerinti eljárással előállított [N<3-pirimidinil-ornitrin B22]-inzulin trisz-oxo-enamin-származékainak sói tehát homoszubsztituált sók [azaz (IA) általános képletű vegyületek] vagy heteroszubsztituált sók [azaz (IB) általános képletű vegyületek] lehetnek. Az (I) általános képlet mindkét vegyülettípust magában foglalja, azaz X és Y azonos lehet Z-vel és R-rel, vagy azoktól eltérő jelentést is felvehet. A találmány szerinti eljárás egyik különösen előnyös kiviteli módját az alábbiakban részletesen ismertetjük. A (II) képletű inzulin és a Z—CO—CH2— CO— R általános képletű /?-diketon reakciójának sebessége a pH emelkedésével nő; ennek megfelelően a kondenzációt előnyösen bázikus közegben hajtjuk végre. Tekintettel arra, hogy erősen lúgos közegben a fehérjék irreverzibilis változást szenvednek, a reakciót általában pH~8 értéken, pufferelegy — pl. megfelelő mennyiségű di-alkálifoszfátok és mono-alkálifoszfátok elegye —-, vagy célszerűen alkálifémhidrogénkarbonát — pl. káliumhidrogénkarbonát — jelenlétében hajtjuk végre. Az utóbbi esetben a reakciót zárt tartályban hajtjuk végre, ugyanis így elkerülhetjük a közeg pH-értékének növekedéséhez vezető hidrogénkarbonát -»- karbonát átalakulást. Az inzulin és a /?-diketon kondenzációját vizes közegben, a reakcióközeg homogenizálását elősegítő, azonban sem az inzulinnal, sem a kondenzáció termékével nem reagáló szerves oldószer jelenlétében hajtjuk végre. Szerves oldószerként előnyösen alkoholokat, így metanolt, etanolt vagy butanolt alkalmazunk. A; víz, alkohol, diketon és alkálifém-hidrogénkarbonát mennyiségét úgy választjuk meg, hogy a közeg teljesen homogén legyen. Ha /?-diketon- -ként, acetilacetont alkalmazunk, a következő^ összetételű elegyekkel dolgozhatunk: Káliumhidrogénkarbonát Víz Alkohol Acetilaceton 3-5% 32% 32% 32% 3-5% 38% 29% 29% 3-5% 48% 24% 24% Az inzulin és a /?-diketon kondenzációjának teljessé tétele érdekében a /5-diketont igen nagy fölöslegben alkalmazzuk, így 1 g inzulin átalakításához 20—30 g (azaz néhányszázszoros fölöslegben vett) acetilacetont használunk fel. Ha /?-diketonként acetilacetont alkalmazunk, célszerűen 1% mennyiségű inzulint tartalmazó reakcióelegyben végezzük a reakciót. 2%-nál nagyobb inzulinkoncentráció esetén a reakció sebessége lelassul, és 5%-os koncentrációnál a pirimidin gyűrűzáródása az elméletileg elérhető átalakulási fok 90%-ánál leáll. A reakcióidő és a hőmérséklet egymás függvénye. Ha a reakciót vizes-etanolos közegben hajtjuk végre, előnyösen 20—25 C°-on dolgozunk. A fenti esetben +2 C°-on a reakció a pirimidin-gyűrűzárás teljessé válása előtt leáll, míg +30 C°-on az inzulin már irreverzibilis változást szenvedhet. 20—25 C°-on, vizes-etanolos közegben, homogén fázisban, káliumhidrogénkarbonát jelenlétében az inzulin-amino-csoportjainak blokkolása igen gyorsan — néhány óra alatt — lezajlik, ezzel szemben a guanidil-csoport blokkolása lényegesen több időt vesz igénybe. Ha reagensként acetilacetont alkalmazunk, 24 óra elteltével az átalakulás 80%-os, 6 nap elteltével az átalakulási 90%-os, és a reakció gyakorlatilag csak 20 na^ß elteltével ér véget. u nagi A (III) általános képletű vegyületek alkállMmío sók formájában képződnek. A vegyületek xaá&MM fémtartalma rendszerint kisebb az elmélete ifiéi! téknél (6 alkálifématom molekulánkánt)í/sIfeya&iis pH~8 értéken a sóképzés nem-HE^ytstMj&sxaiifi végbe. -3 ißjfornuißioosa Az inzulin és a ß-diketon koröle*záaé|a£SO£gBLV fokozatosan csapadék képződik.IIantód^ístózisöáfti lataink szerint a (VI) és (Ií^aöKktósaas Mépüaiűg vegyületek elegye. A realtttióí^rámíéfíBfehieifcőegsi a (VI) általános képletű -^egxütetggBizbéte S$ÖÍD lubilizálódik, majd a ^-g&feítűitoaraf&gá^aésrttsq reakció lezajlása utáreí (EH) íéifMáimÍBíkÉplaöín vegyület válik ki. /Ezríaí<fsijrararaäijaliß a{AÜ)05Íés guanidil-csoportotó;í tdqkfc»MfeáflDiaÍEg laéfe$fé$űs$§go kör ér véget, iqäii aonßlßffß H—OD—EHO— OD A (III) áltaMbesnMplAiP)vflgxüieÉKzetfe^3iÍád nagymértékben vjéitaáiE aitóiMMfablkKHjfaÉjéztejfeö-sí zetétől. AiSzä3Etezeff91tegaä-ta>bßkjEÖkätfo^toftnn nyüvánuiOftegX nx!©yl9aíc(ifiQí9álllal^nöa9J^fleÉön vegyülÉrt^^*=nbteMíbé^tAsfqMzlHBnBlBÉ^i ^öld&D dik,-élwIeirfeiláitó^íí^^ÍEiMMopri;éiiHiáÍBÉllié^I) A -i$$t) ááitetóBass-ítosfieífeíigrsg^ijIetí xjgássnlánisjl diétocáaüax-giirtaéjéfoiÉaiíkbfi^$^ 9ifiítmái- faHé^&I nÉ^ÍE^gaaxMoiqóíí-aoanBld^'B f (ffií^étő«lBáaßkfbiiJttf^ dulä1BiJmzllm)3B-áägi;ä részi;e^escheMkaaiiaááisctszfejH9 kezeíóAfcjé^leMaajíöi ffittűnikíIíib^őMaQ-elfHKagböD 69 arra következtethetünk, hogy a gii8Jlkltt®S9pcfeíi 65 tok blokkolása nagymértékben megváltoztatja az 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
