161092. lajstromszámú szabadalom • Eljárás oligomicin A előállítására

3 161092 4 molekula acetilezhető hidroxil csoportokat, karbonil csoportokat és telítetlen kötéseket tartalmaz. Tömegspektrográfiásan meghatározott molekulasúlya 772. A tömegspektrumok értelmében az oligomicinek, a peliomicin és a rutamicin igen hasonló szerkezetűek. (HAMBERLIN, J. W., GORMAN, M., AGTARAP, A.: Characterisation of oligomycins and related antibiotics. Biochem. Biophys. Res. Comm. 34, 448 [1969]). A találmány célja olyan új eljárás kidolgozása, mely üzemi szinten, egyszerű módszerek alkalmazásával lehetővé teszi, hogy az oligomicin komplex három komponense közül csak egy; az oligomicin A keletkezzék, és ez a fermentáció után egyszerű módon legyen elkülöníthető. A találmány alapja az a felismerés, hogy a Streptomyces diastatochromogenes törzs speciális kezelése útján olyan új variáns nyerhető, amely megfelelő fermentációs körülmények között az oligomicin komplex A, B és C komponensei közül csak az A-t termeli. A törzset Streptomyces diastatochromogenes var. 03-nak neveztük el, és letétbe helyeztük az Országos Közegészségügyi Intézetnél 60. sz. alatt. A találmány további alapja az a felismerés, hogy az új Streptomyces diastatochromogenes variáns tenyésztésére előnyösen használható komplex táptalaj. Ez a felismerés azért meglepő, mert az eddig leírt tenyésztési módszerek Streptomyces diastatochromogenes esetén kizárólag szintetikus, ill. félszintetikus táptalajt alkalmaztak, és a komplex táptalajt oligomicin komplex termelésre kimondottan kedvezőtlennek minősítették (VISSER, J., WEINAUER, D. E., DAVIS, R. C, PETERSON, W. H., NAZAREWITZ, . és ORDWAY, H.: J. of Biochem. and Microbiol. Techn. and Engineering II/l, 31/1960; 816 070 sz. angol szabadalmi leírás [1956]). Vgéül a találmány alapja az a felismerés, hogy az alábbi komplex táptalajon egyetlen antibiotikumként termelt oligomicin A a micéliumhoz kötődik, és az irodalmi adatokkal ellentétben ehhez a fermentáció során különböző anyagok adagolása nem szükséges. A találmány eljárás kísérő komponensektől gyakorlatilag mentes oligomicin A előállítására mikrobiológiai úton, ahol a mikroorganizmust 24—32 C°, előnyösen 26—30 C° hőmérsékleten, aerob körülmények között tenyésztjük, majd az oligomicin A-t a micéliumról izoláljuk és ezt követően átkristályosítjuk. A találmány értelmében a tenyésztést Streptomyces diastatochromogenes var. O3 mikroorganizmussal (letétbe helyezve az Országos Közegészségügyi Intézetben 60 sz. alatt) végezzük komplex fehérjét, szénhidrátot és szervetlen sókat tartalmazó táptalajon, és adott esetben a terméket vizes etanolból, majd vizes metanolból kristályosítjuk át. Komplex fehérjeként szójalisztet, kukoricalekvárt és kazeinhidrolizátumot célszerű használni. Szénforrásként glükózt, valamint kiegészítésként szervetlen sókat használhatunk. Ilyen tenyésztési körülmények között az irodalomban eddig leírt eljárásokkal ellentétben gyakorlatilag tiszta oligomicin A termelődik. A törzs fenntartását előnyösen burgonyakivonat-glükóz agáron végezzük. 5 A fermentációs hőmérsékletet célszerű 26—30 C° között tartani; optimális hőmérséklet 30 C° a növekedő, 26 C° a termelő szakaszban. A táptalaj sterilezését 120—122 C°-on, 30 percen keresztül előnyös végezni. Habgátlóként pálmaola-10 jat vagy polipropilénglikolt használhatunk. Sterilezés előtt a pH-t célszerű 7,0—7,2-re állítani. A steril táptalajt ismert módon a Streptomyces diastatochromogenes var. O3 törzs spóraszuszpenziójával vagy vegetatív tenyészetével 15 oltjuk. Az inokulum mennyisége a főfermentáció indításakor az oltásra kerülő táptalaj térfogatának 10—20, optimálisan 15%-a. A fermentációs befejezés után a tenyészet pH-ját oxálsavval vagy más ásványi savval pH 3 és 4 közé ál-20 Htjuk. A hatóanyag a micéliumhoz kötődik és a fermentáció pH-ján rosszul szűrődő férmentlé könnyen szűrhetővé válik. A tenyészetet megszűrjük, ill. centrifugáljuk. A gyakorlatilag hatóanyagmentes szűrletet kiontjuk, a nedves vagy 25 száraz micéliumot pedig vízzel elegyedő szerves oldószerrel extraháljuk. Az extraktumot csökkentett nyomáson, 40 C° alatti hőmérsékleten bepároljuk mindaddig, amíg a habzás ezt megengedi. A visszamaradó vizes maradékot etil-30 acetáttal, vagy vízzel nem elegyedő egyéb szerves oldószerrel extraháljuk. A szerves oldószert nátriumszulfáton szárítjuk és egyidejűleg aktív szénnel derítjük, majd csökkentett nyomáson, 40 C° alatt az oldószert 35 eltávolítjuk. A visszamaradó olajos maradékot petroléterrel extraháljuk. A petroléter kioldja a hatóanyag mellől az olajos szennyező anyagokat, és így halványsárga nyers por marad vissza. A nyersterméket metanol—víz, illetve etanol—víz 40 elegyből átkristályosítjuk. Különösen nagy tisztaságú, kromatográfiásan egységes oligomicin nyerhető a nyerstermék etanol — vizes átkristályosítását követő metanol —• vizes átkristályosításával, ill. szilikagél oszlopokon végzett ad-45 szorpciós kromatográfiájával. A találmány szerinti eljárás főbb eiőnyei a következők: a) Első ízben teszi lehetővé, hogy az A-val jelölt oligomicin komponens gyakorlatilag tiszta, 50 kromatográfiásan egységes formában legyen előállítható, anélkül, hogy ehhez költséges kromatográfiás eljárást kelljen alkalmazni. b) Az antibiotikum a micéliumról izolálható. c) A fermentáció során nincs szükség pH állí-55 tásra. d) A feldolgozás során rendkívül tiszta anyag nyerhető az átkristályosításokkal. A találmány szerinti eljárást az alábbi kiviteli példákkal szemléltetjük. 60 1. példa a) Fermentáció A Streptomyces diastatochromogenes var. O3 65 burgonyaglükóz agárról nyert spóraszuszpenzió-2