161023. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szervek, élő szövetek és élelmiszerek konzerválására biológiai proteáz-inhibitorok segítségével

161023 jufc. A félvesék egyik csoportjait fiziológiás konyhasó^aldatlba, míg: a másik csoportot 8 mg/ /ml mennyiségű kallifeieiinnbripszm-inhiMtort (KTI) tartalmazó konyhasó oldatba helyezzük. A szerveket szobahőmérsékleten, steril körülményiek között tároljuk az oldatban, majd különböző időközönlkénit steril körülmények között kiemeljük, és ismert szövettani vázsgálatokkial, valamint enzirnnhisztokémiai vizsgálatokkal meghatározzuk épségüket. Az enzimXhisztokémiiiai vizsgálatok céljaira a szövetidairaibokat fagyasztás uitán metsszük ki, vagy Woltmatn módszerével, ill. semleges, pufferolt formaiinban fixáljuk. A Woliman imódszeréviel fixált szövetet metilbemzoát fölött paraffinban ágyazzuk, és szövettani vizsgálatokhoz használjuk: fiel. A íormaltaiban fixált SiZövietet fagyasztás után mnetsszük, és a Mdiroláziok előáBftáisiához alkalmazzuk. A fcöveitikező enzimeket állatjuk elő: NADH-dtakrom-c-rediuktáz (NADH-C-R), lakitát-dehidrogeniáz (LDH), gjiükóz^6-fosztfát-dehidiri0genáz (G6PDH), szukcmoáHüidirögeiniáz (SHD), citakromoxildáz (CO), nem specifikus észteráaok (UE), lúgos foszflaitiáadk. (AU) és savanyú foszfatázok (SP). A Mdrolázok szövettahi kimutatását A. G. E. Paarse módszerével (Histochemistry; Tbeoretdical and Applied, 3.. kiadás. Kiadó: J. a. A. Churehil Ltd., Ixmidon, 1988) végezzük, miig a többi enzimeit T. Barka és P. J. Anderson módszerével (Histochemistry; Theory, Practice and BibMography, kiadó: Harper amid Row, Publishers, Inc., New York, 19iÖ3) azonosítjiuk. A szövettani színreakciók közül a hematoxilliineozin festést (HE) és a Goldnetr-festést vizsgáltuk. A fiziológiás konyhasóban végzett 6 órai imkubálás utáin a plazma hematoxálin-eozinaiial lényegesein gyengébb szmreákciót laid, és a csöves sejtek megduzzadnak. Az egész szövet erősen fellazul. A laktátdeMdrogenáz-, NADH-citokrom-o-Tteduktáz és sziukoiniodeihidroigeniaz^-akitivitás még nem csökkan egyértelműen, a szemcsék alakja és vastagsága azonban már rendellenessé válik. A glükóz-6-íoszfát-dehidrogenáz vizsgálata során, elsősoriban a juxtalmedulliáris zónáiban, hiasonlió elváltozások figyelhetők meg. A citokromöxidáz lazonoisítása során foltos feistődést kapunk. A nem spedifükus észterázok vizsgálata során a csöves sejtekben a színezék szabálytalanul oszlik meg, és színezékrögök képződnek, az enzim aktivitása 'a velőben csökken. A savanyú foszfiatázok színrealkciója csökkent aktivitásira és durvább szamcséződésrie utal. A kalffikire!in^trips2in-4nhilbii|tc)ir oldatban tárolt szövet 6 óra elítéltével még mindig jól festhető hematoxilin-elozinnal, a ifestnetöség csak csekély mértékben' csökken, és a .szövet alig duzzad. A csövek erősen elhatároltak. A felsorolt enzimekkel végzett színreakciók a normál szövet vizsgálata során tapasztalt reakciókkal csaknem teljesen azonosak. Az enzdmek lakitiviitása erős, és szabályszerűen oszlik meg. A szmezókszemosék AaMban jól elkülönülnidk. A fiziológiásjkonyhasóban tárolt szöveten 24 óra múlva -az autolizis előrehaladása figyelhető meig. A sejtmagok megszürkülnek, és — elsősomban a szövet belső szelvényeiben — már 5 meni festhetok. A csövek falai elvékonyodnak, és az üregek már nem-zártak. A teljes szövetein a feloldódás kezdeti jlelei figyelhetők meg, még az imiterstáicáiális kötőszövet is nagymértékben feloldódott. A laktáitdehidroganáz, NADH-ciito-1° krom-c-red^ulktáz, «zukcinodeMdirogenáz és cítofcromoixidiáz festése során a szónezékrászeoskék homogén tömeggé állnak össze, és a sejtmagok a festett tartományban nem különülnek el élesein. A glükóz-i6-<foszfiáit>-delhiidiriogenáz aktivitása 15 nagymértékben csőikként. A nem-specifikus enzimek teljesen eltűntek. A lúgos foszfatázok egy része ugyan még erős aktivitással rendelkezik, az «inzim azonban összetapadt rögöket képez. A savanyú ídsafíaitázok homogénen sztíine-20 ződnék, és akltiiviitiásiuk erősen csökkent. A kallitoein-itripszin-inhilbiitiar jelenlétében tárolt szövetben 24 óra elteltével a sej'tmag-szerkezet csaknem teljesen változatlan. A kezdeti autolizis egyes jeled' ugyan megfigyelhetők, a szövet 25 azonban zárt, és a kötőszövet is ép. A megfestett ^enzimekben a színezék szabályszerűbben oszlik el, és az enzimek': akttiváitása az előző értékeknél sokkal níagyobb. A glükóz-6-foszfáitdehidroigeniáz esetében kezdeffl. aktivitásosökke-30 nés észlelhető, és a nem-specifikus enzimek nem mutathatók ki. A kallikrein-triipszin-inihibitor jelenlétében tárolt anyag a legerőselblbein a savanyú foszfatázok tekintetében különbözik a kontroli-szövettől: a savanyiú foszfotázok ak-35 tivdtása és szerkezete gyakorlatilag változatlan maradt. A kalldlkrem-tripszáinrinhibitort nem tartalmazó közegben tárolt szövet 5 nap elítéltével tel-40 jesen felbomlik. A szövet hamlaitoxillitn-eözinnal gyakorlatilag niem festhető, és csak néhány sejtmag mutatható ki. A laktát-dehidrogenáz és NADH-citokiroim-c-rediuktáz festése során homogén tömeg képződik. A citokromoxidáz és a 45 lúgos foszfatázok nemi [mutathatók ki. A savanyú foszfatázok aktivitása még kimutatható, szerkezetüket azonban elvesztették. A kallikrein-tripszinHinhÄMtor jelenlétében tárolt szövetben 5 nap elteltével a kéregszövet szerkezete 50 még jelentős részben ép maradt, és a csövek nagy része megtartotta eredeti alakját. A laktátdehidrogenáz és NADH-cáitokrom-c^reduktáz festése során nagymennyiségű szemcse képződik. A laktát-dehidrogenáz esetén a gloimerusok 55 nem festődnek, és így elkülöníthetők. A citokromoxidáz enzám jól kimutatható. A savanyú foszfatázok aktivitása a kontroli-szövetben mértnél erősebb, és jobb eloszlást mutatnak. 60 2. példa:' Egészséges patkányokiból eMvolított imájszövetet 5 mm-es élhosszú kockákra vágunk, és a 65 szövetdarabokat az 1. példában leírt módion, 2