160823. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a negamicin antibiotikum előállítására

160823 11 12 gyantát tartalmazó kolonnán engedjük át (átmérő 16 mm). A gyantát 200 ml vízzel mossuk és a negamicint 0.5 n HCl-<val eluáljulk. Amberlite IR—45 (OH-forma) gyantával végzett semlegesítés után az aktív frakciót vákuumban szárazra pároljuk. A 300 mg negamicin hidrokloridot, mint nyers port (tisztaság 21%) kapjuk. 2. példa Az 1. példában előállított 300 mg negamicin hidroklorid nyers port 10 ml víziben oldjuk. Az oldatot 60 ml Amberlite CG—50 (NH4

-forma) gyantát tartalmazó oszlopon engedjük át (átmérő 16 mm), (majd desztillált vízzel mossuk. Az elfolyó oldatot 10 milliliterenként frakcionáljuk. Az elfolyó aktív oldatot 10 milliliterenként frakcionáljuk. Az elfolyó aktív oldatot az 57—59 10 15 frakciókban találjuk. Az 57—74 frakciókból 25 negamicint (tisztaság 68 /íg/ml) gyengén sárgás por formájában kapunk. A 75—85 frakciókból 20 mg tiszta negamicint színtelen por formájában kapunk, A 86—96 frakciókból 19 mg anyagot (tisztaság 910 jWg/ml) kapunk. 3. példa A negamicin elkülönítésére az ioncserélő gyanták különböző fajtáit vizsgáltuk. Az 1. példa szerinti eljárással kapott 200 ml tenyészet-szűrletet 10 ml ioncserélő gyantát tartalmazó oszlopon (átmérő 10 mm) engedjük át. Az oszlopot 50 ml vízzel •mossuk és az előbbiekben megadott módon eluáljuk. Az ioncserélő oszloip mosására használt vízben aktivitást nem találtunk. Az eredményeket az alábbi táblázat mutatja: Ioncserélő gyanta típus elució a kapott 2% NH4

OH negamicin Amberlite IRC—50 H-tf orma 2% NH4

OH 45% Amberlite IRC—50 70% Na forma 2% NH4OH 52% Amberlite IRC—50 70% Na forma 1 N HCl 29% Amberlite IRC—50 70% NH4

forma 2% NH4OH 55"/0 Amberlite IR—120 H forma 4-/0 NH4OH 45% Lewatit SP—100 H forma 2% NH4OH 500/o 4. példa: Az 1. példában megadott anyagokat tartalmazó 10 liter tápoldatot 20 literes üveg-fermentorba öntjük. Sterilizálás után a táptalajt 500 ml M890—C3 számú törzs rázott tenyészetével csíramentesen beoltjuk. A fermentálást 27 C°-on 90 óra hosszat levegőztetés és keverés közben Végezzük. Ezt a fermentlevet (pH 7.4) a micéiium elválasztására centrifugáljuk és így 6460 nil (41 //g/ml) szűrletet kapunk. A szűrletet 400 nil Amberlite IRC—50 (70% Na-forma) gyantát tartalmazó, 30 mm átmérőjű oszlopon engedjük át. Az oszlopot 3000 ml vízzel mossuk, majd a negamicint 2%-os ammóniával eluáljulk. A 400 ml iáktív eluátumot csökkentett nyomáson szárítjuk, és; így 685 mg nyers negamicint (tisztaság 150 ',Mg/ml) — mint barna port — kapunk. .5. példa 102 mg negamicint 8 ml 15% etilénglikol monometilétert tartalmazó vízben oldunk. Ehhez az oldathoz 106 mg natrium-p-hidroxiazobenzol-p'-szulfonátot adunk. Az elegyet oldódás céljából 50 C°-ra melegítjük és 0.5 ml 1 n HCl hozzáadásával a pH-t 3-ra állítjuk be. Az elegyet jégszekrényben állni hagyjuk és így 49 mg sárgás-narancs kristályokat kapunk. Az anyagot kevert oldószerből (víz 4.5 ml és metanol 0.5 ml) atikristályosítjuk és így 28 mg sárgás-narancs kristályokat kapunk, 0.p. 180—182 C° (bomlik). A kristály az E. coli KI 2 mikroorganizmussal szemben a szabad negamicin 34%-ának megfe-35 lelő aktivitást mutat. ' Elemzési eredmények: C9H20N4O4 (Ci2

HioN

2

0

4

S)2-'2H20 képletre: ' Számított: C 47,13; H 5,27; N 13,33; O 26.64; 40 S 7,63; Talált: C 47,09; H 5,16; N 13,20; O 25.53; S 8,01. 45 50 55 60 fi£> 6. példa 130 liter táptalajt, mely 3% glükózt, 1% keményítőt, 2% szójabablisztet, 0,5% száraz élesztőt, 0,35% CaCOa-t, 0,0005% CuS04

•

5H2

0-t, 0,0005w MnCl2

-7H

2

0-t és 0,0005% ZnSCv 7H2

Ot tartalmaz, 200 literes rozsdamentes acél fermentorba öntünk. A táptalajt 30 percig 120 C°-on sterilizáljuk, majd az M890—C2 számú törzs 1,2 1 tenyésztésével csíramentesen beoltjuk. Fermentáció alatt (113 óra) a tenyészetet 200 ford/perc sebességgel keverjük, 25 l/perc sebességgel levegőt vezetünk be és a hőmérsékletet 27 C°-on tartjuk. A fermentlé 110 literét (pH 7.4, 63 //g/ml) 8 kg * diatóma-földdel szűrjük, majd 1 1 6n HCl-<al a pH-t 4,9-re állítjuk be. A szűrő mosására használt mosóvízzel együtt öszszesen 117 1 szűrletet kapunk; ezt 6,5 1 Amberlite IRC—50 '(70% NH4

-forma) gyantát tartalmazó oszlopon engedjük át. Vizes mosás után a negamicint 0,5 n ammóniával eluáljuk. Az aktív eluátuin 3 literét osökkentett nyomáson 495 ml-6