160823. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a negamicin antibiotikum előállítására
160823 8 semlegesítésére alkalmazható anélkül, hogy a gyantán az antibiotikum lényegében adszorbeálódna. Fermentléből a micélium szűréssel, vagy centrifugálással távolítható el. A micéliumot tartalmazó fermentlé a gyantaoszlopra a micélium eltávolítása nélkül is ráengedhető, ha a nagyobb részeket fémszita alkalmazásával előbb eltávolítják, nehogy azok az oszlopra lerakódva azt eltömjék. ,, A Str. purpeofuscus fermentlevéből a negamicint a következő, egyik alkalmazható módszerrel különítjük el: á fermentlevet szűrjük vagy centrifugáljuk és a szűrlétet, vagy a felső folyadékréteget 70% NH4-formát tartalmazó ioncserélő gyantaoszlopon engedjük át, vízzel mossuk és az adszorbeált negamicint 2,0% NH4OH tartalmú vízzel eluáljuk, majd az eluátumot csöükentett nyomáson az ammónia eltávolítása céljából betöményítjük. A betöményített oldatot OH-formában levő Dowex 1X2 oszlopon engedjük át, vízzel mossuk és a gyantán levő negamicint 0,5 n HCl oldattal eluáljuk. A negamicint tartalmazó eluátumot OH-formájú IR45 gyantával semlegesítjük és csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A negamicin hidrokloridot nyers por formájában kapjuk meg, mely anyagot vízben oldjuk és Amberlite CG—50 (Rohm and Haas Co., USA, márkanév) NH4-formájú gyantán engedjük át, majd vízzel, vagy 0,1%-os NH4OH oldattal leoldjuk és a negamicint tartalmazó frakciókat vákuumban bepároljuk. A tiszta negamicint fehér por formájában kapjuk, melyet — ha tisztasága nem megfelelő — kromatográfiás módszerrel ismét tisztítunk. A negamicint bázikus tulajdonsága alapján vízben oldhatatlan sav hozzáadásával is kicsaphatjuk. Ilyenek pl. a pikrinsav, p-hidroxiazoben-» zol-p'-szulfonsav, stb. A negamicin, mint a p-hidroxiazobenzol-p'-szulfonsav sója, kristályosodik. A vízoldhatatlan negamicin sókat az ismert módszerekkel választjuk el a vízoldhatatlan savtól, így pl. a negamicin-p-hidroxiazobenzol-p%szulfonátot etanolban HCl-dal kezelve a negamicin hidroklorid válik ki. Vízoldhatatlan sav, mint a Targitol 4, Targitol 7 (Union Carbide and Carbon Chemical, Co.) és nátrium-laurilszulfonát is alkalmazható a negamicin kicsapására. A negamicint az előbb leírt módszerrel tisztítva mint fehér port kapjuk. A negacimin jól oldódik vízben és oldhatatlan metanolban, etanolban, észterekben és benzolban. A negamicin vizes oldatban vég-abszorpciót mutat, de 220—400 m ß között ultraibolya tartományban abszorpciós maximummal nem rendelkezik. A negamicin amfoter, így erősen bázikus és gyengén savas tulajdonságú. A negamicin 3500 V-al és pH 1,8 pufferben {hangyasav-ecetsav-víz 25:75:900 térfogatban) a katód felé 12 m c-t mozdul el; az alanin mozgékonyságát 1,0-nak véve ä negamicin mozgékonysága 1,4. A negamicin sósavval, kénsavval, p-hidroxiazobenzol-p'-szulfonsawal, pikrinsawal, stb. addíciós sókat képez. A negamicin karbonsav-csoporttal rendelkezik és így fémsókat és észtereket lképez. Ninhidrin és Ryv don-Smith reagenssel pozitív, antron és Saka. gucthi reagenssel negatív reakciót ad. A negamicint 6 n HCl-ban 105 C°-on hat óra hosszat me-5 legítve, a hidrolizátum több mint 3 ninhidrin terméket ad. A három fő hidrolízis-termék: 5--hidroxi-/?-lizin, N,N'-dimetilhidrazin és metilamin. Szarkozin és 1-metilhidrazineoetsav a hidrolízis-termékben csekély mértékben található. !0 A legtisztább negamicin 75 C°-tól fokozatosan olvad és 110—120 C°-on habzás közben bomlik. Elemzési eredmények C9 H 2 oN 4 0 4 • 2H2 0 képlettel: számított: C 38,02; H 8,51; N 19,71; O 33,77; 15 talált: C 37,78; H 8,62; N 18,94; O 31,70; Titrálási egyenérték 287. A negamicin p-hidroxiazobenzol-p'-szulfonátot, mint sárgás-narancs kristályokat kapjuk; ez 180—-182 C°-on bomlás közben olvad és a negamicinhez képest 20 kb. V3 antiibakteriális aktivitást mutat. Elemzési eredmények C9 H 2 oN 4 0 4 (C12 HioN 2 0 4 S)2 • 2H2 0 képlettel: számított: C 47,13; H 5,27; N 13,33; O 26,64; S 7,63; 25 talált: C 47,09; H 5,16; N 13,20; O 25,53; S 8,01, A negamicin három titrálható pK értéket ad: 3,55, 8,10 és 9,75. A negamicin káliumbromiddal mért infravörös spektrumában abszorpciós sávok figyelhetők 3ü meg a következő cm-1 hullámszámoknál: 3430, 3200, 3050, 2950, 1680, 1590, 1405, 1320, 1140, 1050, 970, 890, 820, 720. A negamicin-p-hidroxiazobenzol-p'-szulfonát abszorpciós sávjai a következő cm-1 hullámszámokat adják: 3550, 3400, 35 3350, 3250, 3200, 3050, 2950, 1730, 1690, 1600, 1560, 1510, 1440, 1430, 1400, 1360, 1280—1100, 1060, 1030, 1010, 990, 960, 945, 900, 880, 850, 800, 715, 680. Ebben a sóban a karbonsav sávja 1730 cm-1 hullámszámnál mutatkozik. A negamicin-40 -metilészter infravörös spektruma a következő cm-1 hullámszámoknál mutat sávokat: 3400, 320Ö, 3000, 2950, 1740, 1665, 1600, 1485, 1445,1400,1220, 1140, 1050, 1000, 960, 890, 720. Az észtercsoport sávja 1740 és 1220 cm"1 . 45 A negamicin előbbiekben ismertetett szerkezetét a negamicin metilészter és a triacetil-negamicin-metilészter tömegszínképe és a hidrolízis-termékek szerkezetének vizsgálata alapján állapítottuk meg. A negamicin a gram-negatív és gram-pozitív organizmusok növekedését gátolja. Az antibakteriális hatást agrár-vonalas módszerrel tesztelve, hús-extrakt-pepton-agár alkalmazásával, a következő organizmusok fejlődését a következő koncentrációkban gátolja (20 óra hosszat tenyésztett kultúra oltótűnyi mennyiségével sávot húzunk; a zárójelben levő értékek a parciális gátlóhatás koncentrációját mutatják): Staphylococcus aureus 209 p 50 ftgfml; Staphylococcus aures 60 193 12.5 /tg/ml (6.12 ^/aml); Staphylococcus, aureus Smith 50 pgfraí; Sarcina lutea PCI—1001 12.5 /ig/ml (l,56>g/ml); Bacillus subtilis NRRLr-B558 25 jug/ml <12.5 ,'^g/ml); E.ooli K12 3,12 65 //g/ml (1.56 ;«g/ml); E. coli NIHJ 12.5 //g/ml (3.12
