160606. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 8-izo- prosztaglandin-F1-analógok előállítására
47 160606 48 tiloleátot adunk: hozzá. Négy darab 500 ml-es lombikban a fenti táptalajból 100—100 ml-t helyezünk el és beoltjuk Cladosporum resinae (G 1—11, ATCC 11.274)-vel, majd szöbaihőmiérsékleten (ikib. 28°) 4 napig rázatjuk. A tenyésze- S tet ezután 40 ml-es centrifuga-csövekbe helyezzük és klinikai centrifugáiban kb. 2000 fbrd/perc sebességgel centrifugáljuk. A centrifuga-csövekből származó folyadékot dekantáljuk és az öszszegyűjtött sejteket hideg vízzel mossuk. Két 10 céntrifugáló-csőből a mosott sejteket felszuszpendáljuk 50 ml jéghideg 0,05 mólos 7,0 pH-jú foszfátpufferban és elhelyezzük egy jéggel hűtött kisméretű Waring keverőben. Üveggyöngyöket adunk hozzá és a szuszpendált sejteket 15 15 percig keverjük a keverőben. A kapott, zúzott sejteket • tartalmazó szuszpenziót klinikai centrifugában szobahőmérsékleten 15 percig kb. 2000 fond./perc sebességgel centrifugáljuk, majd a szupematáns folyadékot összegyűjtjük. Ez a 20 szupematáns folyadék Cladosporium resinae acilázt tartalmaz, és azt közvetlenül felhasználhatjuk PGEi-alkilészterek hidrolizálására, vagy előnyösen fagyasztva tárolhatjuk, ameddig az szükséges. 25 A 6—12. frakciókat egyesítjük és aceton— —Skellysolve B (hexán izomerek) elegyéből kristályosítjuk. A kristályokat szűréssel elkülönítjük, éterrel mossuk és szárítjuk. Így 30 mg kristályos PGEi-et kapunk, melynek olvadáspontja 115—116 °C, autentikus PGÉi-el kapott keverék-olvadáspontja pedig 114—1.14,5°. Optikai forgatóképességi diszperziós görbéje az autentikus PGEi optikai forgatóképességi diszperziós görbéjével azonos. C. A d, 1-PGEi-metilészter észteráz hidrolízise: Cladosporium resinae acilázt tartalmazó szupematáns folyadékból 12 ml-t — melyet kb. három hétig fagyasztva tároltunk — és 129 mg d, 1-PGEi-metilésztert elegyítünk, és kb. 20 órán keresztül szóbahőmérsékleten nitrogén alatt rázatjuk. Az elegyet ezután 100 ml acetonnal hígítjuk, szűrjük és a szűrletet csökkentett nyomáson bepároljuk. Az így kapott maradék d, 1-PGEi-et tartalmaz. A maradékot Silic AR CC-4-«n (Mallinckrodt) kromatografáljuk. Az oszlopot Skellysolve B-etilacetát és etilacetát-metanol eleggyel eluáljuk az alábbiak szerint: B. A PGEi-me+ilészter észteráz-hidrolízise A példa A. pontjában leírt módszerrel előállított Cladosporium resinae acilázt tartalmazó szupematáns folyadékból 10 ml-t és 50 mg PGEj-metilésztert szobahőmérsékleten nitrogén alatt rázatunk kb. 19 óra hosszait, majd 70 ml acetont adunk hozzá és az elegyet szűrjük; így szűrletet és oldhatatlan maradékot kapunk. Vékonyréteg-kromatográfiás analízis (szilikagél lemezen, előhívás kloroform-ecetsav-metanol 90 : 5 : 5 : eleggyel) azt mutatja, hogy úgy a szűrlet, mint a szűréssel kapott oldhatatlan maradék PGEi-et tartalmaz. A szűrletet csökkentett nyomáson bepároljuk, és így 40—50 mg kissé sárga olajat kapunk, ami PGEi-ből áll. Ezt az olajat és az oldhatatlan maradékot egyesítjük és 10 g savval mosott szilikagélen (Silic ARCC—4, Mallinckrodt) kromatografáljuk. Az eluálást növekvő mennyiségben etilaoetátot tartalmazó hexán izomerekkel (Skellysolve B) végezzük ós 50 ml-es frakciókat gyűjtünk az alábbiak szerint: Frakció Oldószer 30 35 40 45 50 Frakció Oldószer 1 Skellysolve B 2 40 ml Skellysolve B, 10 ml etilacetát 3 30 ml Skellysolve B, 20 ml etilacetát 4 25 ml Skellysolve B, 25 ml etilacetát 5 20 ml Skellysolve B, 30 ml etilacetát 6 10 ml Skellysolve B, 40 ml etilacetát 7 5 ml Skellysolve B, 45 ml etilacetát 8 etilacetát 9 etilacetát 10 etilacetát 11 12 etilacetát 100 ml etilacetát 60 50 ml Skellysolve 45 ml Skellysolve 1 ' 40 ml Skellysolve 35 ml Skellysolve 30 ml Skellysolve 2 25 ml Skellysolve 3 20 ml Skellysolve 4 15 ml Skellysolve 5 15 ml Skellysolve 6 10 ml Skellysolve 7 10 ml Skellysolve 8 5 ml Skellysolve 9 5 ml Skellysolve 10 50 iml etilacetát 11 50 ml etilacetát 12 50 ml etilacetát 13 50 ml etilacetát 14 50 ml etilacetát 15 50 ml etilacetát 16 ] 00 ml etilacetát 17 : 100 ml etilacetát B B + B + B + B + B + B +• B + B + B -j-B + B + B + 5 ml 10 ml 15 ml 20 ml 25 ml 30 ml 35 ml 35 ml 40 ml 40 ml 45 ml 45 ml etilacetát etilacetát etilacetát etilacetát etilacetát etilacetát etilacetát etilacetát etilacetát etilacetát etilacetát etilacetát -f- 1% metanol + 1% metainol -j- 2% metanol -j- 2% metanol -j- 3% metanol + 4% metanol A frakciókat bepároljuk és vékonyréteg-kromatoigráfiával analizáljuk. A 7—9. frakció d, 1--PGEi-metilésztert (összesen 66 mg), a 10. és 11. frakció d, l-PGEt és d, 1-PGEi-metilészter elegyet (összesen 20 mg) és a 12—16. frakció d, 1-PGEi-et (összesen 33 mg) tartalmaz. 21. példa: d, 1-8-izo-PGEi-metilészter az endo sorozatból 47 mg 6-endo-(l',2'-dihidroxiheptil)-2/ i9-(6 ? '-karbometoxihexil)-bicikloi[3.1.0]hexan-3-on 2 65 ml száraz piridinnel készült oldatát jégfürdő-24
