160550. lajstromszámú szabadalom • Eljárás (-) (cisz- 1,2-epoxipropil)-foszfonsav és sói előállítására

160550 6 oen. át 1 ait nyomáson lautokláviban melegítjük. A tápoldatot öltótű segítségével beoltjuk az As.pergfflus niger NRRL—67 ferde-agár oltóanyagával, majd rázógépen 220 ford/perc és kb. 5 cm lökethassz mellett 28 C°-on 4 napon át inkubáljuk, míg jól kifejlett haktériuimtenyészietet nem kapunk. Ebből a tenyészetből 10 ml-t csíramentesen ibeöntünk a csoitriíugaesőbe és 25 000 gvsl centrifugálva a sejteket tömörítjük. A felülúszó folyadékot elöntjülk és a tömörített sejteket 4 ml 0,05 m trisz^flhidroximetilj-aminometán pufferrel f(trisz-pufifer) ,pH 8,0-ra állítjuk be. Az így kapott sejt-szuszpenzióból 2 ml-t csíramentesen beöntünk egy í2i0 X 200 mm-es steril tenyészcsőba, mely 2O0 y- raoém nátriuimHmonometil-ícisz^l^-epoxipropilJ-foszfonátot tartalmaz 2 ml pH 8,0-cna beállított 0,005 m tírisz^hidroximetilí-iaminometán pufferben. A tenyészcsöivet 48 óra hosszat 28 C°-on rázógépen inkübáljulk. Az így kapott, inkubált tenyészetet 25 000 g-n centrifugáljuk, és a felülúszó folyadék biológiai aktivitását Proteus vulgaris MB-838-oal (ATOC 21100 és NRRL B—3361) korongkísérlet segítségével vizsgáljuk; a vizsgálat eredménye szerint az ún. gátolt zóna, vagyis az az átmérő (mm-ben), amely körülveszi a korongot, amelyben a Vizsgált mikroorganizmus növekedése megszűnt, 26 mm, így indikálva a (—)(ciszl,2-epoxipropil)-foszfonsavnsó jelenlétét. A két kontroli-csövet, melyek közül az egyik a pH 8,0-ra beállított 2 ml 0,05 m triiszr-puffert és 2 ml sejt szuszpenziót, míg a másik 4ml triszpuffert és 200 y racém nátriumHmonometil-(cisz-1,2-epoxipropil)-f oiszfonátot tartalmaz, azonos módon 48 óra hosszat 28 C°-on inkubáljuk. Mindkét ellenőrző cső íelülúszó folyadékát Proteus vulgaris próbával vizsgálva gátlóhatást nem találunk. A Proteus vulgaris MB—838 próbát a következő módon készítjük el: A próbatenyészetet mint ferde-kultúrát táp-agaron (Difco) és 0,2% élesztő extrakton (Difco) tartjuk fenn. A beoltott ferde-tenyészetet 37 C°-on 18—24 óra hosszat inkubáljuk, majd hűtőszekrény hőmérsékletén tároljuk. Minden héten friss ferde-tenyészetet készítünk. A kiértékelő lemezek oltóanyagát minden nap elkészítjük, ferde-Jtenyészetből vett kaparékkal, 50 ml táipfőzetet (Difco) és 0,2% élesztő extraktot tartalmazó 250 ml-es Erlenmeyer lombik beoltásával. A lombikot 37 C°-on 18—24 óra hoszszat rázógépen inkubáljuk. A főzet-4enyészetet ezután 0,2% élesztő extrakt oldat hozzáadásával 660 ni« hullámhosszon 40% áteresztésre állítjuk be, Bausch et Lomb Spectronic 20 készüléken mérve. Meghatározáshoz a nem, beoltott főzetet mint valkpróibát használjuk. A beállított főzet-tenyészet 30 ml-ét alkalmazzuk 1 1 táptalaj beoltásához. A 0,2% élesztő-extrafctot (Difco) tartalmazó tápagart (Difco) mint értékelő-táptalajt használjuk. A táptalajt elkészítjük, autoklávban sterilizáljuk, és állni hagyjuk, míg 50 C°-ra le nem hűl. A táptalaj beoltása után 10 ml-t egy steril petricsésizébe öntünk és megszilárdulásig állni hagyjuk. 5 A fel ül úszó folyadék mintáját a vizsgálathoz 0,05 m trisz-pufferben pH 8,0-ra beállítva a megfelelő koncentrációra higítjuk. A vizsgálandó oldatba a tárcsákat bemártjuk és a kiértékelő le-10 mez felületére helyezzük; minden mintaból két tárcsát helyezünk egy lemezre egymással szemben. Két másik tárcsát bemártunk 0,4 egység/ml (—)(eisz-l,2-epoxipropil)-foszfon9avat tartalmazó oldatba, és az előbbi tárcsák közé, egymásísal 15 szemben a korong felületére helyezzük. Az így elkészített kiértékelő korongokat 37 C°-on 18 óra hosszat inkubáljuk, omajd mm-ben lemérjük a zóna-átmérőket, melyek a gátolt kísérleti mikroorganizmust (Proteus vulgaris) tartalmazó ko-20 rong körül kialakulnak. A minta aktivitását nomogramból, vagy standard görbéből határozzuk meg. 1 mg tiszta i(—)(cisz-jl,2-epoxipropil)-foszfonsav 357 egységet tartalmaz; (az „egység" egyenlő a termék azon koncentrációjával, mely 25 28 mim átmérőjű gátlási zónát hoz létre.) 2. példa Az 1. példa szerinti eljárást ugyanazokkal az 30 anyagokkal, mennyiségekkel és reakciókörülmények (mellett, de Aspergillus niger helyett Ashbya gossypii NRRL Y 1056-tal lefolytatva és a felülúszó folyadékot Proteus vulgaris próbával vizsgálva 18 mm átmérőjű gátlási zónát kapunk. 35 3. példa Az 1. példa szerinti eljárást 200 y nátrium-mionoetil-racém|(cisz-l,l2-epoxipropil)-foszfonát-40 tal megismételve és a felülúszó folyadékot Proteus vulgaris próbával vizsgálva, 30 mm átmérőjű gátlási zónát kapunk. 45 4. példa Az 1. példa szerinti eljárást monometil-észter helyett azonos mennyiségű raoém monopropilészter nátriumsó jávai lefolytatva és a kapott fe-50 lülúszó felyadékot Proteus vulgaris próbával vizsgálva, 20 mm átmérőjű gátlási zónát kapunk. 55 60 5. példa Az 1. példa szerinti eljárást monometil-észter helyett azonos mennyiségű racém monoallil-észter nátriumsójával lefolytatva és az így kapott felülúszó folyadékot Proteus vulgaris próbával vizsgálva, 30 mm átmérőjű gátlási zónát kapunk. ,6. példa Teljesen az 1. példa szerint járva el, csak az-65 zal a különbséggel, hogy az Asbbya gossypii 3