160408. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 66-40 antibiotikum előállítására
13 160408 14 pasához szükséges mennyiségű oxájsarvat adunk, és megszűrjük. A szűredéket ammóniumhidroxiddal ismét közömbösítjük. Ezután a szűredéket 1900—2000 g IRC—^50 Amberlite-et ammóniumfázisban tartalmazó katioinkicserélő oszlopra visszük fel. Az eluátuimot kiontjuk, a gyantát vízzel mossuk, és 2 n amimóniumhidroxidoldattal eluáljuk. 400 ml-es frakciókat gyűjtünk, és ezeket S. aureusszal {ATCC 6538P) vizsgáljuk. Az aktív frakciókat egyesítjük, és vákuumban szárazra bepárolva kb. 28 g nyers 66—40 antibiotikumot kapunk kb. 500 <"g/mg titerrel. 3. példa: A 66—40 antibiotikum tisztítása A 2. példa szerint kapott 28 g nyers 66—40 antibiotikumot 100 ml desztillált vízben feloldjuk, és felvisszük egy hidroxilfázisban levő anicnkieserélő oszlopra (Dowex 1X2). A gyantát (2000 g) vízben szuszpendálva felöntjük egy 63,5 mm átmérőjű és 914,4 mm magas oszlopra. Az oszlopot kb. 23 ml/perc sebességgel desztillált vízzel eluáljuk, 100 ml-es frakciókat gyűjtünk, és kondjuktometiikusan és Staphylococcus aureusszal vizsgáljuk. A vizsgálat alapján durrván elválaszthatjuk az antibiotikumot tartalmazó eluált frakciókat az antibiotikum mentesektől. Hogy a frakciókat valóban helyesen kombináljuk, mindegyik frakció egy részét papírkromatügraf áljuk, 2:1:1 arányú kloroform-metanol-17%ros ammóniumhidroxid rendszer alsó fázisát felhasználva. Minden papírt megpermetezünk ninhidrinnel, és a hasonló anyagot tartalmazó eluátumokat egyesítjük, és liotfilizálva kb. 5,7 g 66—40 antibiotikumot kapunk kb. 900 ßgjmg titerrel. 4. példa: 66—40 .antibiotikuim tisztítása szulfátján át A 3. példában leírt módon készült 3,9 g 66— 40 antibiotikum bázist 60 ml vízben oldunk, és a pH-ját 6 n kénsawvall 4,6-re állítjuk be. Az oldatot aktívszénnel keverjük kb. 1/2 óra hoszszat és megszűrjük. A szűredéket kb. 1 liter metanolhoz adjuk. Szűrés és szárítás után 4,8 g szulfátsót kapunk kb. 640 Mg/mg titerrel. 200 g Whatman 1. sz. cellulózport összekeverünk egy 2:l:ll arányú kloroiform-metanol-17ü/oos ammóniumhidroxid oMatrendszer 20 ml-nyi felső fázisával, és apró szegmensekben megtoltunk vele egy 6,35 mim átmérőjű és 508 mm magas oszlopot. Az oldatrendszer alsó fázisát átbocsátjuk az oszlopon, amig a szennyezések sárga sávja tűnik elő. A fentiek szerint készült 2 g 66—40 antibiotikum-szulfátot feloldunk kb. 3 ml felső oldószerfázisban, és némi cellulózporral keverve és vákuumban megszárítva felvisszük a cellulóz-oszlop tetejére. Az alsó fázisát az oldatrendszernek átbocsátjuk az oszlopon percenként 1 ml ütemben, 5 ml-es frakciókat gyűjtve 15 percenként. 5 Mindegyik frakcióból alikvot mennyiséget szűrőpapírra viszünk, és ninhidrinnel megvizsgáljuk az antibiotikum jelenlétére. Az antibioí.'-kumot tartalmazó frakciókat papírkromatogr;:fáliva kitűnik, hogy a kívánt anyag a 121. és 10 190. frakciók között helyezkedik el. A 121—130. frakciókat egyesítjük, száraz-a bepároljuk, vízben újra oldjuk, és átbocsátjuk hidroxilfázisú ERA 401S anionkicserélő gyan-15 tán. Az eluátumot beállítjuk kénsawal 4,5 pH-ra, aktívszénnel kezeljük, szűrjük, és kis térfogatra koncentráljuk. A koncentrátumot föl'".:: mennyiségű metanolhoz adjuk, és a képződ") fehér csapadékot szűréssel elválasztjuk. A csa-2c padékot vízben oldjuk, és hidroxilfázisban levő IRA 401S gyantás oszlopon bocsátjuk át. Az átfolyó folyadékot összegyűjtjük, bepereljük, és liofilizálva kb. 300 mg 66—40 antibiotikum bázist kapunk kb. 1000 ,«g/mg titerrel. 5. példa: Kristályos 66—40 antibiotikum-monohidrát előállítása ,26 cm magas és 2,5 cm átmérőjű kovasavgél kromatográfiai oszlopot készítünk, kifejlesztőéi uensként 1:2:11 térifogatarányú izopropano!-kloroform-ammóniumhidroxid oldószerkeverék alsó (szerves) fázisát alkalmazva. 1,0 g 66—40 antibiotikum bázist feloldunk 5,0 ml oldószerkeverékben. Az antibiotikum oldatot felvisszük a kavasavgélre, és kromatografáljuk. 5,0 ml-es frakciókat gyűjtünk, és a kívánt frakciók helyét kovasavgéllemezeken végzett vékonyréteges kromatografálással megállapítjuk. A megfelelő, 44—78. frakciókat egyesítjük, és vákuumban bepárolva halványsárga szirupot kapunk, amely etanollal való azeotrop desztilláció után halványsárga rozetták alakjában kristályosodik ki. Az így kapott termék az antibiotikum monohidrátja kb. 185—iI90 °C olvadásponttal. A hozam kb. 650 mg. 6. példa: 66—40 antibiotikum benzaldehides kondenzációs termékének előállítása 55 5,0 g 66—40 antibiotikumot 60 ml vízmentes etanolban 5$ g benzaHehiddel (5 egyenértéksúly kevés felesleggel) visszaifolyatás közben I óra hosszat forralunk. Az oldatot lehűtjük, te, a kapott 7,0 g fehér kristályos anyagot szűréssel elkülönítjük. Olvadáspontja 12i3—126 °C: [a]26 D = 4-43.2° (c = 0,3%, kloroformban). Az elemanalízis szerint 5 benzaldehid maradék 65 van jelen. 7
