159839. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-aszparagináz dúsítására

159839 3 4 az így kapott tiszta oldathoz további polietilénglikololdatot adunk, az üledéket ismét elválasztjuk és ezt a műveletet tetszés szerinti gyakorisággal megismételjük. A frakcionálás során kiváló csapadékok egy része túlnyomórészt biológiailag aktív anyagot tartalmaz egy kevés iners protein mellett. A csapadék megtisztítása a rátapadt polietilénglikoltól úgy történhet, hogy a csapadékot vízben feloldjuk, az oldatot az oldhatatlan részecskéktől megszabadítjuk és acetont adunk hozzá feleslegben. Ekkor az L-aszparagináz csapadék formájában kiválik, a polietilénglikol pedig oldatban marad. Az eljárást más oldószerrel, pl. kis szénatomszámú alkohollal is végezhetjük. Másrészt a csapadék oldatából a polietilénglikolt extrahálhatjuk is olyan oldószerrel, amely az enzimet nem denaturálja és vízzel nem elegyedik, pl. diizopropiléterrel. Továbbá az oldott csapadékból a polietilénglikolt, amelynek a molekulasúlya nem haladhatja meg a 10.000-t, dialízissel is eltávolíthatjuk és az enzimet a nem diaíizálható részből kifagyasztással nyerjük ki. Eljárhatunk úgy is, hogy a csapadékot megszárítjuk, majd acetonnal vagy más oldószerrel extraháljuk. A fenti műveleteket célszerűen 0 C° és +40 C° közötti hőmérsékleten hajtjuk végre. Az enzim kiválása a vizes oldatból a pH-értéktől függetlenül bekövetkezik, de célszerűen a 4—10 pH-érték tartományban dolgozunk. Más poliglikolok, pl. polipropilénglikol is alkalmas az eljárás végrehajtására. Egy amerikai munka-csoport 1967-ben leírt egy eljárást szérumok, illetve plazmák részleges frakcionálására polietilénglikol segítségével (v.ö.Fed.Proc.1967, 3218). Egy meghatározott enzim, pl. az L-aszparagináz polietilénglikol-oldat segítségével történő szelektív kicsapására mindmáig nem ismeretes analóg eljárás az enzimkémiában. Az új eljárás előnye az eddig ismert L-aszparagináz dúsítására szolgáló módszerekkel, pl. az ammóniumszulfáttal történő kicsapással szemben az alábbiakban foglalható össze: 1. Gyakorlatilag tetszés szerinti mennyiségű nyers aszparaginázzal dolgozhatunk anélkül, hogy a kitermelés romlana. 2. Erősen koncentrált vizes oldattal dolgozunk, ezáltal az enzim oldószerrel történő kicsapás vagy kifagyasztás segítségével könnyen, dúsított formában nyerhető ki. 3. A felesleges polietilénglikol oldószerrel könnyen eltávolítható. 4. Az eljárás a kristályos aszparagináz előállítására szolgáló eljárásnak egyik lényeges lépése. A leírt módszer két kicsapási lépéssel kb. 3-4 egység/mg tisztaságú nyers aszparaginázból 70—80 egység/mg tisztasági fokú termék elérését teszi lehetővé. A klinikai felhasználásra kerülő L-aszparagináz esetén a gyakorlatilag elérhető maximális tisztasági fokot kell megközelíteni. Ezért az ilyen célú eljárásnak technikai méretekben is végrehajthatónak kell lennie. Azt találtuk továbbá, hogy a polietilénglikollal történő kicsapás szelektivitása jelentősen javítható, ha a kicsapás előtt az L-aszparagináz oldathoz karbamidot vagy más olyan amidot adagolunk, amely a hidrogén-híd kötéseket megbontja. flyen oldatból az L-aszparagináz viszonylag nagy, kb. 150—200 g pohetÜénghkol/liter koncentráció esetén kezd kiválni, az iners protein és különböző szennyező anyagtartalom pedig sokkal kisebb, mint 5 azonos koncentráció mellett, de karbamidot nem tartalmazó oldatból történő kicsapás esetén. Ezeket a műveleteket célszerűen -4 G° és +40 C° közötti hőmérsékleten hajtjuk végre. Az enzim kiválása a vizes oldatból a 6—10 pH-érték tartományban 10 független a pH-értéktől. A polietilénglikolos kicsapás során képződő üledékben visszamaradt karbamid eltávolítható pl. oly módon, hogy az üledéket vízben felvesszük és a polietilénglikolos kicsapást megismételjük. 15 Karbamid helyett más, a hidrogénhid kötéseket megbontó amidokat, pl. guanidint, formamidot, acetamidot és más vízoldható amidokat is alkalmazhatunk. A karbamid és más amidok proteineket dezaggregáló hatásáról számos cikk jelent meg (1. pl. 20 J.Biol.Chem. 123 (1938), 543). A pótlólagos eljárási lépés előnyei az alábbiakban foglalhatók össze: 1. Sikerült két kicsapási lépéssel az L-aszparaginázt olyan tisztaságban kinyerni, amely eddig techni-25 kai körülmények között nem volt lehetséges. . 2. A - pl. karbamiddal biztosított — jobb oldódási tulajdonságok következtében nagyobb koncentrációjú vizes L-aszparagináz oldattal dolgozhatunk, ezáltal a technikai eljárás jelentősen egyszerűbb. 30 3. A polietilénglikolos kicsapás eredményei pl. karbamid jelenlétében a nyers aszparagináz változó minősége ellenére is jobban reprodukálhatók. 4. Az eljárás a kristályos aszparagináz előállításának egyik igen lényeges lépése. A fehérje-kémiában 35 szokásos módszerrel, pl. magnéziumszulfáttal, ammóniumszulfáttal, acetonnal stb.-vel történő kicsapással szemben sikerül az enzimet kristályosodásra bírni. Továbbá azt találtuk, hogy az L-aszparagináz tisztasága tovább fokozható, ha a polietilénglikolos 40 kicsapással 100-500 egység/mg protein aktivitási fokig előretisztított enzimet az enzim izoelektromos pontján vetjük alá kicsapásnak. Az enzim kb. 4,9 pH-értéken levő izoelektromos • pontján kevésbé oldódik, mint az oldatban szokásosan előforduló összes többi protein. Ez az L-aszparagináz csapadék alakjában való kiválásához vezet, amelyet még egy kevés polietilénglikol vagy vízben oldódó szerves oldószer hozzáadásával is elősegíthetünk. Ezt a műveletet célszerűen úgy hajtjuk végre, hogy a pH-értéket 4,9 és 5,5 közötti értékre állítjuk be, és a kicsapást alacsony hőmérsékleten folytatjuk le. A találmány szerinti eljárás előnyeit a szóbanforgó 55 tiszta vagy módosított polietilénglikolos módszerekkel szemben az alábbiakban foglaljuk össze: 1. Csak kis mennyiségű kicsapó szerre van szükség vagy nincs szükség annak alkalmazására. 2. Egy 100-150 egység/mg protein fajlagos akti-60 vitású L-aszparaginázból kiindulva 190 egység/mg protein fajlagos aktivitású anyaghoz juthatunk. 3. A módszer segítségével kristályos L-aszparagináz előállításához szükséges kiindulási anyagot kapunk. 65 Az L- aszparagináz preparátumok előállítása során, pl. az E. coli-ból kiinduló módszer esetén, amelyet Campbell és társai írtak le (v.ö.Biochemistry j6