159730. lajstromszámú szabadalom • Eljárás száraz eznzim készítmények előállítására

3 159730 4 A találmány szerinti eljárás során a fehérjék, kiváltképpen enzimek kicsapására tehát a molekulában szén-, szulfon-, szulfoxi-, szulfonimidhidakat tartalmazó egy- és többértékű fenolok, fenÄarlborasiavlafc, fenolBzulfonsavaik valamiiint fenalszadífxmamddok, Oágmiiniszulfonsava'k és aromás aminők kondenzálási termékeit használjuk. A találmány szerinti eljárás magába foglalja továbbá az änionos és kationos szintetikus cserzőanyagoknak fehérjék, kiváltképpen enzimek mikrobiológiai tenyésztőoldatokból vagy más növényi vagy állati extraktokból való kicsapására történő felhasználását. Míg a fehérjék kicsapását eddig tanninnal, ligninnel vagy természetes csersavakkal végezték, a találmány szerinti eljárás során szintetikus cserzőanyagokat használunk. Az enzim-cserzőanyag-komplex kicsapásának előfeltétele, hogy: 1. a szintetikus cserzőanyag csak kevés erősen poláros csoportot (pl. —SO3H) tartalmazzon, és 2. a szintetikus cserzőanyag egyes molekulái a kolloid-diszperz nagyságrendbe tartozó nagyobb molekulákat képezzenek. A megfelelő nagyságú molekula képzése az oldat cserzőanyagkoncentrációjának növelésével és az oldötit sók pH-értékének vagy az oldat ionerősségének változtatásával érhető el. Ezeket a paramétereiket az ensáim tulajdonságai (izoelektromos pont, pH-stabilitás) vagy a cserzőanyag típusa határozza meg. A szintetikus cserzőanyagok szulfonálási foka csupán az anionos cserzőanyagoknál játszik szerepet. Egyértékű fenoloknak formaldehiddel képezett kondenzációs termékeinél, ahol molekuláidként 3—4 arilűsoipant van, például egy szulfonsavcsoport elegendő. Többértékű fenoloknak, pl. rezorcinnak a kondenzációs termékeinél a szulfonálás felesleges. A szulfonálásra abban az esetben van szükség, ha a kondenzációs termék különben oldhatatlan. A túl intenzív szulfonálás azonban az enzimhozamot csökkenti. A találmány szerinti eljárás során a fehérjetartalmú oldatokat a szintetikus cserzőanyagokkal oly módon elegyítjük, hogy a cserzőanyag koncentrációja az elegyben előnyösen 0,5—5% vagy ennél több legyen". A fehérje kicsapását melegen (50 C°-Sg), szdbahöménsékMen vagy hűtés alkalmazásával végezhetjük. A keverés közben kicsapódó fehérje-cserzőanyag-adduktot centrifugálással, szűréssel vagy dekantálással elkülönítjük, majd vízben vagy szerves oldószerben szuszpendáljuk. A vízzel a feleslegben levő cserzőanyagot valamint a szervetlen sókat kivonjuk, a szerves oldószerrel pedig a kicsapott termékből a kötött cserzőanyagot és a további sókat távolítjuk el. Szerves oldószerekként az egy- és kétértékű alkoholok, valamint a vízzel elegyedő ketonok, glikoléterek, a dioxán és a tetrahidrofurán mutatkoztak alkalmasnak. Az enzimtartalmú kicsapott termék aktivitáscsökkenésének elkerülése céljából a szintetikus cserzőanyagok extrahálását célszerűen 0—- +10 °C-on végezzük. A kicsapott terméket a tisztasági követelményeknek megfelelően szerves oldószerrel újra mossuk vagy a szokásos módon azonnal szárítjuk. A találmány szerinti eljárás kiviteli módját közelebbről az alábbi példák szemléltetik. A pél-5 dáklbam szereplő Bacillus IsuWtlilis tenyészetek nem azonosak. A példlákíban említett etnziimaktivitások menését a következő módszerekkel végeztük : 1. Amiláz. 10 ml 1%-os keményítőoldatot (0,1 10 mólos acetátpufferban, pH == 6) 1 ml hígított tenyészetszűrlettel vagy készítmény-oldattal 25 C°-on inkubálunk. Az inkubáció kezdetén és végén (15 perc múlva) 1—1 ml mintát veszünk és ezeket 100 ml-es mérőlombikokba visszük át, 15 amelyekbe előzetesen 10 ml 0,1 n sósavat és 10 mi 0,01 n jódotLdaitot mértünk. A feltöltöttt lombikokból a minták extinkcióját 580 nm-en 0.5 cm réfegvastiagsiággial mérjük. Az aktivitás 20 A = 78,5. AE.V/e, ahol AE = az extinkciók különbsége V = a hígítási térfogat (ml) 25 e = az enzimbemérés (mg ill. ml) 2. Proteáz. 10 ml 1,4%-os, 7,3 pH értékű kazeinoldatot 2 ml enzim-hígítással 25 C°-on inkubálunk. Az inkubálás elején és végén (20 perc múl-30 va) 5—5 ml mintát veszünk és mindkét mintához 10—10 ml 5%-os triklórecetsavoldatot adunk. 30 perc múlva a csapadékot centrifugáljuk és a szűrletek extinkciókülönbségét 280 nmen, 1 cm rétegvastagságban meghatározzuk. A 35 proteázaktivitás: P = 0,756 . AE. V/e 3. Lichenáz. 2 ml 1%-os licheninoldatot és 2 40 ml 7,0 pH értékű foszfátpuffert 1 ml enzimoidattal 25 C°-on inkubálunk. 20 perc múlva 2 ml 3,5-dmitroszalicilsaveldatot adunk az elegyhez és 5 percen át forrásban levő vízfürdőn melegítjük, majd gyorsan lehűtjük és az extinkciót a 4S szubsztráttal mint vakpróbával szemben 520 nm-en mérjük. A lichenáz-aktivitás: L = 0,992 AE . V/e 50 ^' /3-glukanáz. A 3.-hoz hasonlóan mérjük az aktivitást, de 1%-os licheninoldat helyett 2%os árpa-/?-glukánt használunk. Az aktivitás: G = 0,992 . AE . V/e 55 5. Karboximetilcelluláz. 1%-os nátrium-karboximetilcellulózoldat viszkozitásának az enzim hatására bekövetkező csökkenését mérjük 30 C°-on. A célszerű viszkozitáscsökkenés kb. 25%. g0 1. példa Amiláz-készítmény Amiláz kicsapására Bacillus subtilis tenyészet fi5 szűrletét használjuk. 1,5 liter amiláztartalmú 2 V