159651. lajstromszámú szabadalom • Eljárás B12-vitamin termelésének fokozására
3 159681 4 3. A baktériumtömeg kiülepítése, a felülúszó kimerült táptalaj elöntése és újjal való pótlása. Mindhárom módszert kipróbáltuk és mindhárom használhatónak bizonyult, ipari alkaí- ..•;• mazás szempontjából azonban különbség van 5 köztük. Az 1. pontban említett módszerrel kapcsolatban megjegyzendő, hogy, mivel az oxigén a Propionibactériumokra a növekedési fázisban káros, az illékony savak elűzését nitrogénné], 10 szénsavval vagy más közömbös gázzal kell végezni, olyan pH-értéken, ahol a nevezett savak túlnyomó többsége már szabad sav alakjában van jelen. Ez a pH a baktériumok számára kedvezőtlen, tehát szakaszosan kell a gázát- lg fuvást végezni és közben a pH-t semlegesi-e visszaállítani. A 2. pontban említett módszernek az a hátránya, hogy viszonylag bonyolult készüléket igényel, amelyben az anód porózus fallal elválasztott rekeszben van elhelyezve. Nagy előnye viszont e módszernek, hogy a káros anionok eltávolítása mellett alkalmas a tenyészet pH-jának automatikus szabályozására is. A 3. pontban említett módszer, amely elvileg eltér az előző kettőtől, többféle módon is kivitelezhető. Így például: ,'. a) A baktériumtömeget steril körülmények közt lecentrifugáljuk. b) A baktériumtömeget megfelelő módszerrel kiülepítjük. Ilyen módszert ad meg például a 145 902 számú magyar szabadalomj amelynél azonban erősen lúgos vegyhatás áll elő és ez káros lehet a baktériumokra, ha a műveletet nem kellő gyorsasággal hajtják végre. Erre vonatkozik a 155 546 számú magyar szabadalom is, amely azonban tapasztalatunk szerint kevéssé megfelelő módszert ír le. 40 Azt találtuk, hogy a baktériumtömeg lecsapására igen jó módszer valamely oldható alumínium-sóból és vízüvegből Al-szilikát képzése ;magában a fermentációs lében, amely a baktériumokat jó hatásfokkal adszorbeálja és 45 gyorsan ülepedő csapadékot szolgáltat. Az üledéket dekantáljuk, a felülúszót leszívjuk és elöntjük, a csapadékot esetleg steril vízzel átmossuk, ismét dekantáljuk és a mosó- 80 vizet is elöntjük. Ügy is eljárhatunk, hogy a fermentlevet steril vízzel hígítjuk és ezután csapjuk ki a baktériumtömeget. Végül a baktériumokat tartalmazó csapadékot friss táptalajjal az eredeti térfogatra feltöltjük, bármi- s ^ lyen módszerrel állítottuk is elő a csapadékot. A baktériumok lecsapását és a táptalaj-cserét természetesen akkor célszerű végrehajtani, amikor a régi táptalaj kimerült, vagyis szénhidrát- 60 tartalma gyakorlatilag nullára csökkent. A műveletet egyszer, vagy egymás után több ízben is végre lehet hajtani egyazon fermentáció során. «n A. találmány szerinti eljárás kiviteli módját a 3. pontban vázolt módszer szerint az alábbi példák szemléltetik. Az első példa azt is megmutatja, hogy szokványos fermentációs technika mellett 2% helyett 4% glükóz alkalmazása (100%-os többlet) csak 51%~os B12 -vitaminhozam-emelkedést eredményez. A tálaim ány szerinti eljárást alkalmazva viszont, 100%-os glükóz-többlet 155%r os Bi2-vitamin termeléstöbbletet biztosít. A 4%-os glükózzal lefolytatott típus-fermentációhoz képest az. új eljárás szerint dolgozva 180%-os B12 -vitamin-termelést kapunk. A példákban leírt fermentációknál összesen 4% glükózt alkalmaztunk. Mindamellett magasabb eredményeket kaptunk, mint: a világirodalomból ismert legmagasabb eredmények, amelyeket 8—10% glükóz alkalmazásával értek el. 1. példa: a) Egy 500 ml-es Erlenmeyer lombikban sterilizálunk 40'0 ml táptalajt, amely a 151 019 számú magyar szabadalom szerint készült, 2% külön sterilizált glükózzal. A táptalajt beoltottuk 10 ml azonos táptalajon készült 6 napos Propionibacterium shermanii tenyészettel. 48 óra múlva megkezdtük a tenyészet pH-jának periodikus szabályozását Na200 3 -mal és a 96. órában 5 /ng/ml 5,6-dimetilbenzimidazolt adtunk hozzá. A 6. napon a tenyészet B]2 -vitamin-tartalma 11,8 /ig/ml volt. b) Az a) pontban leírt táptalajhoz hasonlót készítettünk és 4% külön sterilizált cukrot adtunk hozzá (2%; helyett). A 48. és 114. óra közt NajCOa-mal periodikusan állítottuk a pH-t, majd 5 Mg/ml 5,6-dimetilbenzimidazolt adtunk a tenyészethez. A 140. órában a B12 -vitamintartalmat 17,8 pg/ml-nek mértük. c) Az a) pontban leírt táptalajhoz hasonlót (2% glükóz-tartalommal) a 96. óráig az a) pontban leírt módon kezeltünk, de ekkor nem adtunk hozzá 5,6-dimetilbenzimidazolt. A 102. órában, miután meggyőződtünk róla, hogy a glükóz elfogyott, a tenyészetet előzőleg sterilizált centrifuga-pohárban 20 percig centrifugáltuk, majd a felülúsző tiszta folyadékot elöntöttük. Az üledéket az a) pont alatt megadott táptalajíban (glükóz nélkül) szuszpendáltuk, visszavittük egy steril 500 ml-es Erlenmeyerlombikba, a térfogatot ugyanezzel a táptalajjal 400 ml-re egészítettük ki és a glükózkoncentrációt 2%-ra állítottuk be 50%-os steril glükózoldattal. További 48 órán át N^Oj-mal szabályoztuk a pH-t, majd 5 //.g/ml 5,6-dimetilbenzimidazolt adtunk a tenyészetihez. További 48 óra múlva mértük a tenyészet B12 -vitamin tartalmát, amely 32,5 /tg/ml volt. 2. példa: Egy 10 literes állólombikban 6 liter a 151019 számú magyar szabadalmi leírásban megadott 2
