159630. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bizonyos allergének ellen hatásos reaginimmunoglobulinek kvalitatív és/vagy kvantitatív meghatározására vizes mintákban és az eljárás kivitelezésére alkalmas reagens-kombináció
11 159630 12 C. A reagin-Ig-nek megfelelő ellenanyagok előállítása Kísérleti nyulakat intramuszkulárisan 0.5 mg reagin-Ig és 0,8 ml komplett Freund-féle adjuváns keverékével -kezelünk 0,2 ml 0,15 mólos nátriumklorid-oldatban. A Freund-féle adjuvánst az ellenanyagtermelés fokozása céljából adagoljuk (vö. Cábát és Mayers: Experimental Immunoehemistry, 1961). A reagin-Ig-vel, mint antigénnel végzett immunizációt 14 napon keresztül megismételjük, majd 3 héten keresztül hetente egyszer immunanyagot adagolunk. Ismeretes az, hogy az ellenanyagtermelés az antigén ismételt adagolásával fokozható. A további 10 nap eltelte után a kísérleti nyulakból vért veszünk és a vérből kinyerhető antiszérumot koagulálással regeneráljuk, majd a vérrögöket eltávolítjuk. Az .antiiszérumot 1 óra hosszat +37 C°-on és 16 óra hosszat -f-4 C°-on történő abszorpcióval specifikussá átalakítjuk akként, hogy egy rész normál emberi szérumhoz egy rész antiszérumot adunk. A specifikussá átalakított antiszérumot centrifugáljuk, majd normál emberi szérummal szemben immunoelektroforézissel megvizsgáljuk. Ezenkívül Ochterlony-féle géldiffúziós analízist alkalmazunk tiszta A, G, M, valamint normál G immunoglobulinból és Bence—Jones-jféle fehérjékből kinyerhető rövid poliipeptid láncokat tartalmazó tiszta A, G, M immunoglobulinekkel szemben, amikoris azt találjuk, hogy a kapott termék reagin-Ig-vel szemben specifikussá alakult. Az antiszérumot a meghatározási eljárás során ellenanyagként használjuk. D. Jelzett reagin-Ig előállítása A reagin-Ig-t 3TM izotóppal jelöljük; a radioaktív-jelölésnél a Hunter és Greenwood szerzők által a Nature című folyóiratban (144., 495. oldal, 1962) ismertetett módszert használjuk. E. Meghatározási eljárás Az analízist 50X10 mm méretű üveg-, vagy műanyagcsövekben végezzük. 1. 0,5 ml kémiailag kötött allergént tartalmazó, A) szerint előállított szemcsés műanyagszuszpenzióból 0,5 ml-t mérünk mind- . két kémcsőbe. (A szuszpenzió ml-ként 1 mg részecskét tartalmaz.) 2. A vizsgálandó paciens szérumából 0,05 ml-t az egyik kémcsőbe mérünk. 3. 0,05 ml nem allergiás eredetű kontroliszérumot a másik kémcsőbe mérünk. 4. A kémcsövek tartalmát 20 óra hosszat szolbahőmérsékleten inkuíbáljuk, ez alatt a kémcisöveket függőleges irányban lassan forgatjuk. 5. A részecskéket 1 percig 3000 fordulatszámon centrifugáljuk, majd a felülúszó folyadékot eltávolítjuk. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 tio 6. A részecskéket háromszor 1 súlyszázalékos szarvasmarha szérumalbumint tartalmazó 7,4 pH-értékű 0,1 mólos trisz-ipufferrel mossuk, a szuszpenziót centrifugáljuk és a felülúszó folyadékot minden egyes mosási művelet után leszívatással eltávolítjuk. Minden egyes leszívatási műveletnél ügyelünk arra, hogy a leszívatott folyadékba szilárd, anyag ne kerüljön. 7. A C) szerint előállított és 1 : 500 arányban hígított 0,1 mól antiszérumot minden egyes kémcsőbe bemérjük 8. A kémcsövek tartalmát a fenti 4. pont szerint inkubáljuk. 9. A részecskéket a fenti 5. pont szerint centrifugáljuk. 10. A részecskéket a fenti 6. pont szerint mossuk. IL A D) pont szerint előállított 0,1 ml J 123--reagin-Ig oldatot, amelynek radioaktivitása 50 000 egység/perc, minden egyes kémcsőbe bemérjük. 12. A kémesövek tartalmát a fenti 4. pont szerint inkubáljuk. 13. A részecskéket az 5. pont szerint centrifugáljuk. 14. A részecskéket a 6. pont szerint mossuk. 15. A részecskéket tartalmazó kémcsöveket szcintillációs detektorba helyezzük és a y-sugárzást mérjük. Kiértékelés céljából az egyik csőben mért szcintillációs detektorba helyezzük és a ysugárzás intenzitását összehasonlítjuk a másik kémcsőben mért sugárzás intenzitásával, amely utóbbiban nem allergiás pacienstől származó kontroll szérum van. Alternatív módon úgy is eljárhatunk, hogy a fenti 13. pontban történő centrifugálás után a felülúszó folyadék egy bizonyos hányadát számlálócsőbe átviisszük, majd az oldatban levő ji25_r eagin-Ig y-sugárzását meghatározzuk. Kvantitatív meghatározás céljából 0,05 ml kísérleti szérumot különböző mértékű hígításban a fenti 2. lépésben a kémcsövekbe helyezzük. Egy kémcsősorozatot különböző hígítású olyan szérummal az előzőhöz hasonlóan elkészítünk, amely allergiás pacienstől származik és így standardnak tekinthető. Az aktivitást ezután a standard-szérummal való összehasonlítás alapján mérjük. 2. példa: Növényi eredetű allergen (nyírfa-allergén) ellen felhasználható reagin-Ig meghatározása A. Kémiailag kötött allergént tartalmazó részecskék előállítása Kiindulási anyagként finom szemcseméretű glicerin-éter hidakkal térhálósított dextránt (Sephadex G 25, szuperfinom) használunk, amelyet előzetesen izotiiocianát-fenoxihidroxjpropil-csqportokkal szubsztituálunk R. Axen és J. Porath szerzők módszere szerint (Acta Chem. 6
