159356. lajstromszámú szabadalom • Eljárás B12-vitamin előállítására
5 159356 koricalekvárt tartalmazó fermentációban 6000 y/l-t ért el. A kukoricalekvárból frakciókat készítettünk a következő módon: 1. centrifugálás (n = 800/p); 2. metanol hozzáadása után centrifugálás; 3. sósavas extrakció (p# •= 2), majd centrifugálás ; 4. nátronlúgos extrakció (p# = 10), majd centrifugálás ; 5. vízzel kétszeresre hígítva, majd 50 C°-on 15—20 percig melegítve; 6. vízzel kétszeresre hígítva, majd 85 C°-on 15—20 percig melegítve; 7. centrifugálással leválasztott csapadék metanolos extraktuma; 8. centrifugálással leválasztott csapadék sósavas (pff = 2) extraktuma; 9. centrifugálással leválasztott csapadék nátronlúgos (pH = 10) extraktuma; 10. centrifugálással leválasztott csapadék vizes extraktuma;. 11. centrifugálással leválasztott csapadék vizes extraktuma 50 C°-on. A frakciókat kukoriicalakvár helyett a fermentléhez adtuk és ezután tápláltuk be az 5,6--dimetilbenzimidazolt, majd a sorozatot megismételtük úgy, hogy a betáplálás előtt adtuk a frakciókhoz az 5,6^dimetilbenzim,idazolt, 15— 20 percig kevertük és a keveréket adagoltuk a fermentációhoz. A Bi2-termelés növekedését az 5. és 6. frakcióknál tapasztaltuk. A fermentlé B12 -vitamintartakna elérte a lOOOiO y/l-t. Az optimális p# érték meghatározására a kukoricalekvárt vízzel két-háromszorosára hígítottuk és a pH -t különböző értékekre állítottuk be [pff = 4-^4,5 (eredeti); 2^2,5; 6,5—7; 10] és a frakciókat 15—20 percig 50 C°-on melegítettük, majd hozzáadtuk az 5,6-dimetilbenzknidazolt és 15—20 perces keverés után a fermentációhoz adtuk az elegyet. A fermentlé Bi2 -vitamintartalma az eredeti, p# = 4—4,5 (izoeléfctromos pont pH = 6,5—7) értéken 10—11 000 y/í volt. Ugyanezt a kísérletsorozatot tíz-tizenötszörös hígítású kukoricalekvárral végezve nem kaptuk pozitív eredményt. Ily módon a kukoricalekvár egyes elkülönített komponenseivel és különféle körülmények között nyert oldószeres frakcióival végzett fermentációs kísérletekkel megállapítottuk, hogy az 5,6-dimetilbenzimidazol az említett körülmények között a kukoricalekvár vízoldható peptidjeinek 6,5—7 pff izoelektromos pontot mutató frakciójához kötődik és ezzel képez olyan vízben oldódó komplexet, amely a tápközegben nemcsak oldott és a mikrooirganizmu&ok által hozzáférhető alakban tartalmazza a prekurzort, hanem elősegíti annak belépését a sejt metabolikus folyamataiba és így a Bi2-vitamintermelés legalább 50%-os növekedését eredményezi. A kukoricalekvár-5,6~dimetilbenzimidazol komplex azonosítására a kukoricalekvár két-5 báromszoros mennyiségű vízzel 50 C°-on melegített extraktumát papírkromatográfiás módszerrel analizáltuk. A kapott foltokat összehasonlítottuk a vizes extraktumban oldott 5,6--dimetilbenzimidazol prekurzor inkubált oldatá-10 ból kapott papírkromatogramján és a tiszta prekurzor papírkromatogramján kapott foltokkal. A komplexet tartalmazó papírkromatogramon egy új foltot kaptunk, amelynek Rf értéke !5 (0,68) nem egyezett meg a vizes extraktum foltjainak Rf értékével, sem a tiszta prekurzor Rf értékével (1,45), s ezenkívül a vizes extraktum foltjai közül eltűnt egy Rf = 0,42 értékű folt. Ennek a foltnak a vizes kioldása peptid-20 -reakciót adott. Az új folt vizes kioldásával kapott oldat lúgos hidrolízise után a tiszta prekurzor és a vizes extraktumból eltűnt peptid-reakciót adó folt kifuttatható. 25 A fermentléből a kukoricalekvár-5,6~<dimetilbenzimidazol komplex betáplálása után egy órával centrifugálással sejtmentes levet készítettünk. A lében papírkromatográfiával kimutatható a komplexnek nevezett 0,68 Rf értékű 30 folt. Betáplálás előtt a vizsgálat eredménytelen volt. A komplex alkalmazása előtt, amikor a két komponenst külön tápláltuk be a fermentlébe, 35 a sejtmentes lében a prekurzor 50—60%-a mutatható ki, ami nem épül be kobalaminokba. A komplexszel végzett fermentáció esetén, hosszabb fermentációs idő — 2—3 hónap — után a sejtmentes léből kifuttatott komplex 40 hidrolízisével meghatározlható formába hozott prekurzor egyensúlyi mennyisége a betáplált mennyiség 25—30%-a. Ez az eredmény összhangban van a kobalaminok mennyiségének 25—30%-os növekedésével. 45 Az 5,6-dimetilbenzimidazol prekurzornak a kukoricalekvár peptidjeivel képezett vízoldható komplex alakjában történő adagolása azonban nemcsak a prekurzornak a mikroorganizmusok 50 általi hasznosíthatóságát fokozza és ezzel a B-vitamin termelését és egyúttal a fehérje-szintézist is növeli az említett rendkívül nagymértékben, hanem egy további meglepő és igen előnyös változást idéz elő a mikroorganizmusok 55 tulajdonságaiban. Megfigyeltük ugyanis, hogy ha az eddigi B12 -vitamintermelő mikroorganizmus-populációt 6—8 heti fermentáció során adaptáljuk a prekurzort ilyen Oldható komplex alakjában tartalmazó táptalajhoz, akkor a fer-60 mentáció termékeként kapott, baktériumtestekből álló biomassza a Bi2-vitaimint lényegesen könnyebben feltárható alakban tartalmazza. Az így kapott baktériumtestek feltárásához, a B-vitamin vizes oldatba viteléhez nincsen már S5 szükség 85—90 C°-os hőkezelés alkalmazására; 3
