159302. lajstromszámú szabadalom • Eljárás polimixin B sók előállítására
159302 3 mal (a sómentesített és semlegesített eluátumig 38%-OB hozam) oldja meg a polimixin B, kinyerését. A gyógyászatilag alkalmazható polimixin B szulfát előállítása ebből a bázisból még további jelentős veszteségekkel járó lépéseket igényel. Jelentős hátránya az eljárásnak, hogy a vizes eluátumból a polimixin a nehézkes bepárlás után csak szabad bázis alakjában nyerhető ki, ami igen munkaigényes, és az erősen alkalikus pH miatt igen nagy veszteséggel járó művelet. Az ezzel a módszerrel kapott polimixin bázis az ioncserélős előtisztítás ellenére is igen erősen szennyezett, hamutartalma magas (29%), és igen sok polimixinhez hasonló jellegű, de biológiailag hatástalan szennyező anyagot tartalmaz. gyet leszűrjük (a szűrés igen könnyen és igen jó hatásfokkal végrehajtható) vagy az oxálsavval lesavanyított fermentléhez 1/2 és 1 tf vízzel elegyedő neutrális szerves oldószert, célszerűen metanolt, etanolt, acetont adunk, vagyis oldószeres koagulációval idézzük elő a szennyezések eltávolítását, majd az így kapott elegyet leszűrjük, és a szűrletből a szerves oldószert desztillációval eltávolítjuk, az így kapott szűrt fermentlevekből a polimixin B meglepően kismennyiségű karboxil-típusú kationcserélő gyantával igen jó hatásfokkal csaknem kvantitatíve megköthető. így elérhető, hogy 1000 liter 6000 E/ml polimixin B-t tartalmazó oldatból a polimixin kb. 3 liter gyantán, egyszeri átfolyatáss'al, teljesen megkötődjék. 1 liter gyanta ilyen körülmények között kb. 200 g polimixin B-t köt meg, szemben a 742 589 sz. angol szabadalomban szereplő 0,6 g-mal. Ha a fermentlevet más módszerrel próbáljuk megszűrni, a szűrés gyakorlatilag keresztülvihetetlen vagy igen zavaros és erősen viszkózus szűrletet kapunk, mely a polimixin mennyiségének csak kb. 20—30%-át tartalmazza. A fent leírt szűrési módszereknél meglepő módon azt találtuk, hogy az erős sav és hő hatására bekövetkező bomlás miatt várható hatóanyag csökkenéssel szemben a szűrlet a polimixinnek gyakorlatilag teljes mennyiségét tartalmazza, sőt egyes esetekben a sejtekhez erősen kötött polimixin B felszabadulása következtében még hatóanyag-tartalom növekedés is tapasztalható. A találmány további alapja az a felismerés, hogy a leszűrt erjesztéses oldatból karboxiltípusú poliaikrilsav- vagy polimetakril-vázas kationcserélő gyantán megkötött polimixin B erős ásványi savaik, mint pl. sósav, kénsav stb. viszonylag tömény (1,1—5,0 n), célszerűen 1,5—2,5 n alkoholos, célszerűen metanolos oldatával igen jó hatásfokkal és igen nagy tisztaságban leoldható. Ez az előnyös jelenség különösen abban az esetben tapasztalható, ha a megkötést úgy végezzük, hogy gyanta lehetőleg teljes ioncserélő kapacitását a polimixin B megkötésére használjuk fel, vagyis a megkötést egy adott oszlopon addig folytatjuk, amig az oszlopról elfolyó oldat polimixin koncentrációja el nem éri az oszlopra vitt oldat polimixin koncentrációját, Az ezután kapott nagytisztaságú és igen nagy töménységű (1— 1,5 millió E/ml) eluátumból a polimixin B sók közvetlenül bizonyos vízzel elegyedő, közepes polaritású szerves oldószerekkel, célszerűen acetonnal nagytisztaságú állapotban lecsaphatok. Ez a felismerés azért meglepő, mivel az eddigi, adatok ismeretében ilyen erős savas közegben már jelentős bomlás lenne várható, viszont meglepő módon azt találtuk, hogy a polimixin B szobahőmérsékleten ilyen magas koncentráció esetén még 5 n metanolos-sósavas A fenti eljárás további hátránya, hogy az alkalmazott kationcserélő gyanta még igen nagy gyantaifelesleg esetében is csak igen rossz 20 hatásfokkal alkalmazható a polimixinek fermentléből történő megkötésére. Így a 782 926 sz. angol szabadalomban ismertetett példa szerint az Amberlite IHC 50 gyanta még kétszeres átfolyatás után is csupán a polimixin 72%-át 25 köti meg. A 742 589 sz. angol szabadalom szerint 318 liter polimixin-tartalmú fermentlé megkötéséhez mintegy 20 liter Amberlite IRC 50 gyantát alkalmaznak, mely gyantamennyiség mindössze 12,0 g polimixin B-t képes meg- 30 kötni. A 782 926 sz. angol szabadalom szerint az eluálás hatásfoka (85%) sem kielégítő. Az eljárás további hátránya, hogy a megkötésre a teljes, a baktériumsejteket és a fermentlé szilárd alkatrészeit is tartalmazó fermentlevet 35 használják fel, ami azon túlmenőlég, hogy igen sok szennyezés feleslegesen leköti az ioncserélő gyanta aktív helyeit, az ioncserélős műveleteket technikailag igen erősen zavarja, így a nagyüzemi alkalmazhatóság a fermentlevek 40 jelentős viszkozitása, folytán és a zavaros fermentlé okozta technikai1 problémák miatt kereisztülvihefcetlen. A találmány célja olyan nagyüzemileg is alkalmazható, egyszerű és üzembiztos eljárás 45 kidolgozása, mely alkalmas jóminőségű, a gyógyászati követelményéknek mindenben megfelelő polimixin B sók jó hozammal történő előállítására. ; 50 A találmány alapja az a felismerés, hogy az igen viszkózus (25 C°-on 1000 qp-nál nagyobb viszkozitású) és eredeti állapotban szűrhetetlen fermentlevet savas pH-n, célszerűen 1,5—2; 5 pH között legalább 10. percen át 70—100 C°-.i>.s "55 hőkezelésnek vetjük alá, és ezzel egyidejűleg az oldathoz a kétértékű kationokkal csapadékot adó szerves vagy szervetlen savakat, célszerűen oxálsavat, kénsavat, foszforsavat, citromsavat vagy ezek sóit és/vagy bizonyos szerves g0 vagy szervetlen fehérjekicsapó-fcoaguláltató szerként ismert anyagokat, célszerűen klórozott ecetsavakat, szulfoszalioilsavat, nehézfémsókat adunk, vagyis termikus és kémiai koagulációt idézünk elő, majd az így kezelt ele- 6S 10 15 20 25 30 35 40 45 50 "55 60 2
