159093. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 6-amino-penicillánsav vizes oldatának aelőállítására
7 159093 b Alkotórész g/l szójaliszt 40 kukoricaliszt 40 (NH4 ) 2 S0 4 1 CaC03 10 Ez a táptalaj szintén alkalmas a Streptomyces lavendulae sejtek előállítására és felhasználható a fenti eljárásban; a táptalajt előnyösen autóklávozás előtt pH=7,2—7,4-re állítjuk be. Az 1. példában még egy további választható táptalajt írunk le. Kísérleteink során sok olyan hidrazidot találtunk, melyek a fent leírt eljárás során megnövelt 6-APA termelést okoztak. Ezek: 1. III. általános képletű aromás hidrazidok, melyekben Rl hidrogénatom, rövidszénláncú alkilgyök, (előnyösen Q—C2) vagy hidroxicsoport. Ilyen vegyületek pl. a benzhidrazid, szalidilhidrazid, 4-metilbenzhidrazid vagy hasonlók, de előnyösen a benzhidrazid. 2. Más hidrazidok, melyek 6—APA-termelést fokozó hatást mutatnak, pl. fenilecetsavhidrazid, naftilecetsavhidrazid, 2-tiofénikarboxilsa.v-hidrazid, glicinhidrazid, vajsavhidrazid, tereierbutilkarbazát és hasonlók. Az aromás hidrazidok változó mérvű javulást okoznak a 6-APA termelésben. A választott aromás hidrazid a hatékonyság és költségtényező figyelembe vételével a benzhidrazid. A karbohidrazid erősen növeli a 6-APA termelést, de mivel a /3-laktámgyűrűben a benzhidraziddal szemben nagyobb arányú bomlást okoz, némiképpen degradálja a 6-APA-t. Más hidrazidok, mint például az oxalilhidrazid, acetilhidrazid és izonikotinsavhidrazid inaktívnak bizonyultak. A penicillin V (fenoxiacetamidopenicillánsav) benzhidrazid jelenlétében végrehajtott amidázos hidrolízise után az anyalúg analízise a következő alkotórészeket mutatja ki: 1. Penicillin V 2. 6-aminopenicillánsav 3. fénoxiecetsav 4. benzhidrazid 5. fenoxiacetil-benzhidrazid. Egy sorozat kinetikai vizsgalatot végeztünk, hogy meghatározzuk a Streptomyces lavendulae A.T.C.C. 21 138 teljes sejtjei jelenlétében lejátszódó enzimes hidrolízis optimális körülményeit. A vizsgált paraméterek a következők: penicillinkoncentráció, hidrazidvegyület és hidrazidkoncentráció, hőmérséklet és a hidrolízis foka. Széles körű kísérleteket folytattunk, kiindulási anyagként penicillin G-t (benzilpenicillint) és penicillin V-t alkalmazva; a választott kiindulási anyag a penicillin V. A hidrazid jelenlétében a termelésnövekedés tényének felismerése előtt alkalmazott körülmények között a penicillin V egy nem mérgező sójának (kálium, nátrium stb.) 2%-os oldata Strep-5 tomyces lavendulae jelenlétében átlagosan 30— 40%-os 6-APA termelést adott, 4—12 óra alatt. Ezt követően megállapítottuk, hogy a 2%-os penicillin V oldathoz 2% benzhidrázidot adva, 10 az elegy a 6—APA-termelést 2—3 óra alatt kb. min. 90%-ra emeli. Az eddigiekben a penicillinek enzimes lebontásának hátránya a korlátozott penicillinkon-15 centráció volt. Ha megszabjuk, hogy 2—3%-os penicillinkoncentrációkkal dolgozunk, igen nagy reaktorokat kell alkalmazni és viszonylag kis mennyiségű 6-APA-t nyerünk. A megelőző, hidrazidot nem használó eljárásban a keletke-20 zett 6-APA mennyiségek arányosan csökkentek a penicillinkoncentráció emelésével. 2% penicillinkoncentráció hidrazid nélkül 30— 40% 6-APA-t eredményez. 5% penicillinkon-25 centráció hozzávetőlegesen 15—20, 10%-os penicillin V koncentráció kb. 5%> 6-APA-t eredményez. Azonban hidrazid jelenlétében a koncentráció hatása, amíg ki nincs küszöbölve, némileg befolyásolt. Példáiul, 2% penicillin V koncentráció 30 2% benzhidrazid jelenlétében 90% 6-APA-t ad. 8%-os penicillin V koncentráció benzhidraziddal kb. 70—80%-os, míg 10%-os penicillinkoncentráció benzhidraziddal 60—70%-os 6-APA-termelést eredményez 4—6 óra alatt. 35 Figyelembe véve az enzimes lebontórendszer összes tényezőjét, azaz a hidrolízis fokát, az alkalmazott enzimet, a 6-APA termeléseket és a képződött 6-APA stabilitását, megállapítható, 40 hogy ebben a folyamatban a benzhidrazid a leghatásosabb hidrazid. Különböző benzhidrazid koncentrációkat alkalmazó vizsgálatok során 8%-os penicillin V oldatot használtunk, a pH-érték 7,0, a hőmér-45 séklet 40 °C volt. Benz- A képződött hidrazid 6-APA meny- *«yensú yi Anyag-2% 8,4 mg/óra 63% 91% . 3% 10,6 mg/óra 70% 87% 55 4% 12,7 mg/óra 75% 86% A vizsgálat mutatja, hogy a legelőnyösebb benzhidrazidkoncentráció 3 és 4% között van. Ezen érték felett növekvő /S-laktám bomlást ka-60 punk. Hasonló, pH=7, 8 és 9 értékeken végzett, 8% penicillin V-t és 3% benzhidrázidot felhasználó kísérletek azt mutatták, hogy a legjobb 6-APA es termelés pH=7 és 8 értékek között érhető el. 4
