159067. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a W847-A antibiotikum és származékai előállítására

11 159067 12 da) és az elkülönített W847—C komplexre (6. példa). Részeken egyéb megjegyzés híján súlyrészeket értünk. 1. példa 847 komplex antibiotikum előállítása Micromonospora sp. W847 0,5 ml liofilizált kultúráját 2 literes lombikban hozzáadjuk 500 'ml, sterilizálás előtt híg nátronlúggal 7,5 pH-ra beállított következő összetételű közeghez: Bacto-marhahús kivonat (Difco) 3,0 g Bacto-triptóz (Difco) 5,0 g glukóz 1,0 g burgonyakeményítő 24,0 g Bacto-élesztő kivonat (Difco) 5,0 g kalciumkarbonát 2,0 g csap víz 1000 ml A lombikot a tartalmával forgó rázógépen (percenként 280 fordulat, 5 cm löket) 72 óra hosszat 28 C-on inkubáljuk. 10 liter alábbi összetételű, sterilizálás előtt 7,15—7,25 pH értékre beállított steril termelő közeget töltünk egy fermentorba: triptikáz 170,0 g nátriumklorid 50,0 g dikáliumhidrogénfoszfát 25,0 g glukóz 25,0 g Czapek-Dox-húslé 350,0 g G. E. 60 habzásgátló (General Electric Co.) szükség szerint csap vízzel kiegészítve 10 literre. Ezt a fermentort beoltjuk 500 ml 72 órás fenti módon készült oltótenyészettel. A hőmérsékletet 31 C-ra növeljük, és a fermentlé literére percenként 0,5 liter levegővel való levegőztetés közben percenként 500 fordulattal keverjük. 24 óra múlva a keverést 600 fordulatra, 48 óra múlva 700 fordulatra növeljük. 69 óra elmúltával a fermentációt befejezzük. Ennek az időszaknak a végére az antibiotikumtermelés elérte a maximumát, és a fermentlé antäbiotikuimtarrbalma tovább nem változik. Fermentáció közben a fermentációs keverék pH-ja lényegében 7,2 és 8,2 között marad. A sejttartalom 3,5—4,5 ml állandó értéket ér el. A fermentlé 15—25 mm zónaátmérőt ad korongon S. aureus-szal vagy P. aeruginosával kipróbálva. 2. példa: W847 komplex antibiotikum extrahálása (kromatográfiásan) Az 1. példában leírt módon készült 60 liter teljes fermentlevet híg nátronlúggal 9,5 pH-ra állítjuk be, majd kétszeres térfogatú etilacetáttal 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 extraháljuk. Az oldószeres fázist elválasztjuk, és vákuumban bepárolva 30,0 g olajos maradékot kapunk. Ez az olajos maradék 1:20 hígításban kb. 20—30 mm átmérőjű inhibiciós zónát ad S. aureus-szal és kb. 15—25 mm átmérőjűt P. aeruginosával szemben. Az olajos maradékot oszlopon kromatograf áljuk a következő módon: Oszlopot készítünk 95%-os vizes etanolban szuszpendált 100 g LH20 Sephadex (Pharmacia Fine Chemical, Inc.) felhasználásával. Az olajos maradékot átvisszük az oszlopra, és 200 mg/ó áramlási ütemmel 95%-os etanoüal eluáljuk. Az eluátumot 50 ml-es részletekbén fogjuk fel. A részleteket antibakteriális hatásuk alapján egyesítjük (meghatározva agáron S. aureus ATCC 6538P törzzsel szemben). A leghatásosabbnak bizonyult frakciókat szárazra pároljuk. A szilárd maradékot kevés acetonban oldjuk, és petroléterbe (fp. 30—60 C°) öntjük. A keveréket szárazjég-aceton fürdőbe (kb. —50 C°) helyezzük, és 20 percig állni hagyjuk. Ezután a keveréket szobahőmérsékletre hagyjuk melegedni, és az anyalúgot dekantálással elválasztjuk az olajos maradéktól. Az anyalúgot szárazra bepárolva tisztított W847 komplex antibiotikumot kapunk. 3. példa W847 komplex antibiotikum extrahálása (savas extrakció) Az 1. példában leírt módon kapott 37 liter fermentlé pH-ját 50%-os nátronlúggal beállítjuk 9,5 értékre. Kétszeres térfogatú etilacetáttal extraháljuk, és a kivonatot 2150 ml-re koncentráljuk. Ebből az etilacetátos koncentrátumból 500 ml-t 2 ízben 250—250 ml 0,5%-os (0,14 n) sósavval vagy 0,1 n kénsavval extrahálunk. Az egyesített savas kivonatokat 5%-os vizes nátronlúg hozzáadásával enyhén mteglíúigosítjuík (kb. 8,5—9,0 pH), és 2 ízben 250—250 ml etilacetáttal extraháljúk. Az etilacetátos kivonatokat egyesítjük, és csökkentett nyomás alatt szárazra pároljuk. 4. példa: W847—A antibiotikum előállítása fermentlé közvetlen hidrolízisével Az 1. példában készült összes fermentléhez annyi tömény ammóniaoldatot adunk, hogy ammóniára normál legyen; pH-ja ekkor kb. 10,8. Ezután szobahőmérsékleten 3—4 napig állni hagyjuk, majd Supercelt adunk hozzá, és szűrőre visszük. A szűrt levet 1 ízben Vő térfogat metilénkloriddal extraháljuk. A metilénkloridos kivonatot egyszer vízzel mossuk. A metilénkloridos oldatot kis térfogatra bepároljuk, acetont adunk hozzá, és kikristályosítjuk. A kristályos W847—A-t szűréssel elválasztjuk, és jéghideg 6