158957. lajstromszámú szabadalom • Eljárás pirrolidinkarboxamido-D-galakto-oktopiranozid-tipusú antibiotikumok (linkomicin, celeszticetin) 3-foszfátésztereinek
158957 11 12 500 mg 3-fosafátot vagy farmakológiai szempontlból megfelelő sőt . tartalrimznak . adagolási egységként, és 5—05 súly/térfogat %--ot a rjaranteráffis toészítmiényekbíen. A 3-nfoszfátniaík vagy sójának beadásra kerülő mennyisége függ a beteg élieítarától és súlyától, a kezelni kívánt állapottól, valamint az alkialmazás módjától. Szisztemiikus kezelés céljából kib.. 1 mg/kg/nap — 50 mg/kg/nap dózis előnyös. A kiövetikező példák bemutatják a jelen találmány szerinti" eljárást és annalk termiekéit, de a találmányt magát neim korlátozzák. Valamennyi százalékban kifejezett adat súly szerint, az oldószerelegyekíre vonatkozó adatok pedig térfogait szerint értendők, hacsak nincs, más megjegyzés. 1. példa Linkomiein-3-foszíát A) Fermentáció A Streptomyces roahiei NBRL 3512 törzstenyészietből vett spóráik steril talajban való eloszlatása útján készített inofculummal beoltunk egy sorozat 500 ml-es Erlenmeyer lombikot; mindegyik lombikban 100 ml alábbi összetételű steril oltótáptalaj van, amely 25 g/liter gíükóz-monohidirátot és 25 g/liter „Bhairmiamedia" gyapotmagliszteít (a Trader's Oil Mill Company texasi cég által előállított ipari minőségű gyapotmaigliszt) tartalmaz csapyízfoen. A lombikokat kör-rázó berendezésben 28 C°-on 3 napig rázatva tenyésztést végzünk. A fent' leírt módon készült oltóanyagból 20 ml-t használunk agy sorozat 500 ml-es Erlenmeyer lombik minden, egyes tagjának beioltására; a. lombikok 100—100 ml steril fermentációs táptalajt tartalmaznak, mélyek összetétele a következő: Szacharóz .Nátriumnitrát D iikálluniifoszfát Miagnéziumszulfát Káliumlklorid Vas(H)szu,lfát Csapvíz 30 g/íliter 3 g/liter 1 g/liter 0,5 g/liter 0,5 g/liter 0,01 g/liter 1 l-re Autoklávban történő sterilizálás után, de még a beoltás előtt 50 mg/liter linkomicinhidrokloridfot adunk a fermentációs lombikokban levő folyadékhoz. A fermentációs lombikokban a mikroorganizmust 2 napig 37 C°-on forgó-rázó berendezésben tenyésztjük,. A fermentációs lombikokban a foszforilezési reakciót a linkomlicin aktivitáscsökkenésének mérésével követjük, S. lutfcea szabvány kísérletet használva. 48 óra alatt a 5 beadagolt linkomiicinnek mintegy 80—90%-a foszforileződik az in vitro antilfaafcteriálisan inaktív formáivá. Az S. lutea vizsgálatot a következőképpen végezzük: A kísérlethez 7,0 pH-jú (0,1 mólos) foszfátipu.fferrel 6—8 pH-ra puffe-10 rezett agart használunk. A vizsgálandó anyagot tartalmazó oldatból egy térfogategységet (0,08 ml) elhelyezünk (ráesteppentünk) egy 12,7 mim átmérőjű kísérleti lapra (szűrőpapír), amelyet azután ráhelyezünk az agarlemezre, amely be van oltva a kísérleti milkrooirganizmussal. A biológiai egység az anyagnak azon mennyisége rrá-enként, amely, ha jelen van 1 ml oldatban, úgy 20 mim-es gátlási zónát eredményez. 15 20 25 30 B) Kinyerés. A fenti fermentációt arányosan! felnagyítva fermentációs reaktorban valósítjuk meg, és így 4900 liter fermentációs folyadékot kapunk, amely linkomiiein-3-foszfátot tartalmaz. A linkomicin-3-fo.szifátot úgy nyerjük ki a fermentlébŐl, hogy azt először 2%-nyi diatómaf öld szűrési segédanyaggal szűrjük, miajd a tiszta fermentlewet 400 liter Skéllysolve B-vel (hexán izomerek elegye) extraiháljufc. A tiszta fermientlé pH-ját 5,9nrie beállítjuk, majd kib. 450 liter 9%-os, Skéllysolve B-vel készült dinonilniaftalinszulfonsav-nátriumsó (NiaDN,NS) oldat-35 tal extr&háljuk. Ezt az exitraikaiót megismételjük. A fermentlé harmadik extralkciáját. 300 liter Skéllysolve B-vel végezzük. Valamennyi kivonatot összeöntjük és 200 liter vízzel mossuk. A mosott NaDNNS-es kivonatot 800 liter 25%-40 os Aliquat '336-01 (tiikaprilmetil-amimóniumklorid) Skéllysolve B-ben, és 200 liter vízzel extraháljuk. A kivonatot azután még kétszer extraháljuk vízzel, és a vizes fázist 200 liter Skéllysolve B-MÖI extmháljuk. A vizes fázis pH-ját 45 4,0-re beállítjuk és vákuumban 1©5 liter térfogatra bepakoljuk. Ehhez a koncentrátumhoz 11,2 kg aktív szenet adunk és az elegyet 30 percig keverjük. Az aktívszenes elegyhez 4 kg - szűrési segédanyagot adunk és az elegyet ezu^ tán leszűrjük. A kapott szűrőlepényt 180 liter vízzel, majd 5%-os acetonnal mossuk. A szűrőlepényt azután három ízben, alkalmanként 180 liter 25°7o-os acetonnal extraháljuk. A 25 %-os acetonos eluátumokat egyesítjük, vá-55 kuumhan betaményítjük és fagyasztva szárítjuk, így fagyasztva szárított linkomicin-3-foszfát készítményhez jutunk. Ezt a fagyasztva szárított iinkormoin-3-fG3z~ 60 fátot oszlop-kromatográfiás tisztításnak, majd' ezt követően a 2. példában a klinimiein-3-foszfát előállításával kapcsolatban leírt ellenáramú megosztásnak vetjük alá, ami után tiszta iker-65 ionos linkomicl in-3-;fosiZifá.tot kapunk. 6
