158956. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-halogén-7-dexoxi-1'-demetil-linkomicinek előállítására

158956 13 14 gyakorlatiban mintegy 2—120 óra időtartam szükséges anélkül, nagy ez korlátozó jellegű lenne, de rendesen 24—!7í2 óra elegendő. A biokonverzió előrehaladását és annak teljességét kényelmesen meghatározhatjuk papíresíkkrama-* tográfiával vagy vékonyrétegkromatográfiával [Heftinain: Chromatography (1.9ßl) Reinhold Publishing Co., New York, New York]. Más módon a kiválasztott szubsztrátum demetilezését oly módon valósítjuk meg, hogy azt a mikroorganizmusból kinyert enzimek hatásának, vagy a mikroorganizmus spórái hatásának, vagy a mikroorganizmus egyes elkülönített sejtjei hatáisánaik tesszük ki. Izolált enzimkészítménjíeket a ZJuidweg és szerzőtársai által [Biochim, Biopy. Acta 58, ,131—il<33 (1962)] leírt általános módszernek megfelelően, állíthatunk elő. A spórákkal végzett biokon verziót a 3 03il 379 és a 3 031 382 számú USA szabadalmi leírásokban ismertetett általános eljárásnak megfelelően valósíthatjuk meg. A mosott sejtek elkülönítése fermentációs közegből jól ismert szakmai körökben, lásd pl. a 2 831 789 számú USA szabadalmi leírást. Ebben a leírásban a „demetilezés" kifejezés a mikroorganizmus nyugatomban vagy növekedésben levő tenyészetének enziirriatikus hatását jelenti, amely a fermentáció, körülményei között a szubsztrátum molekulájából egy metilgyök eltávolítását eredményezi. Miután a fermentáció teljessé vált, a kapott II képletű terméket szokásos módon nyerjük ki a fermentléből. Így pl. a fermentlevet valamilyen vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel, mint pl. metilénkloriddal, kloroformmal, széntetrakloriddal, etilénkloriddal, triklóretilénnel, •éterrel, amilacetáttal, benzollal és hasonlókkal extraháljuk, vagy a fermentlevet és a micéliumot szokásos módszerékkel, mint pl. centrifugálással vagy szűréssel elválasztjuk, majd alkalmas oldószerekkel külön-külön extraháljuk. A micéliumot vagy vízzel elegyedő, vagy vízzel nem elegyedő, oldószerekkel extrahálhatjuk, vagy pedig olyan esetiben, ha a micélium terméket egyáltalán nem, vagy csak kis mennyiségben tartalmaz, azt vízzel mossuk és a mosóvizet a szűrt fermentléhez adjuk. A micéliumtól mentes fermentlevet azután vízzel nem elegyedő oldószerekkel extraháljuk, mint amilyenek pl. az előbb felsoroltak. A kivonatokat egyesítjük, valamilyen szárítószerrel, — mint pl. vízmentes nátriumszulfáttal — szárítjuk, és az oldószert szokásos módszerekkel, mint pl. atmoszférikus vagy csökkentett nyomáson végzett bepárlással vagy desztillálással eltávolítjuk. Egy másik változat szerint a fermentléből a terméket. valamilyen nem-ionos adszorbensgyantán vagy szénen adszorbeáljuk, és a terméket egy poláros szerves oldószerrel, mint pl. metanollal, etanollal, ácetonnal, etilacetáttai, metiletilkefonnal, ezek vizes elagyeivel és hasanlőkkal eluáljuk. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Az extrakciós vagy elueiás' eljárással kapott II képletű 1 '^demetil-teiirmékéket a szokások módszerekkel, mint pl. kiromatografálással és/ /vagy kristályosítással és hasonlókkal elkülönítjük és tovább tisztíthatjuk. A II kétpletű terméket szabad bázis vagy savaddiciós só formájában kapjuk meg, az előbbiekben leírt eljárásoknak megfelelően. A következő példák szándéka a találmány szerinti eljárás bemutatása. A példák célja a találmány megvalósítására irányuló legjobb módszer bemutatása és az előbbiekben leírtak kiegészítése további adatokkal a találmány megvalósításának módjára és fogásaira nézve, hogy azt a szakmában jártas személyek képesek legyenek reprodukálni, de a példák az oltalmi kört semmiképp sem korlátozzák. 1. példa: ' 7'(S)-Któr-;

7-dezox!ÍHl '-demetillinkomiem Vegetatív oltóanyagot készítünk a Streptomyoes punipalus NRRL 3529 kultúrájából oly módon, hogy a tenyészetet 3 napig növesztjük kb. 28 C° hőmérsékletein lengő mozgást végző rázólombikban (2150 ford/pere, 2 1/2 cm lökethossz); a táptalaj összetétele: .25 g/liter Pharmamedia í(gyapotmagliszt, Traders Protein Oil Mill Co., P. O. Box 1837, Fort Wort, Texas 781100) szaprvízben. A táptalajt beoltás előtt sterilizáljuk. A kapott oltótenyészettel beoltunk egy 20 g/liter fekete melaszfoól, 30 g/liter dextrinből, 15 g/liter hallisztből és 15 g/liter Pharmaimediaból álló táptalajt. Ezt a táptalajt 7,!2 pH-ra beállítjuk és '1120 db 500 :ml-es rázólombíkba 100—100 ml táptalajt teszünk. A rázótombikokat sterilizáljuk (a pH a sterilizáció után 6,2) és az előbbiek szerint előállított vegetatív oitótienyészettel beoltjuk, 100 ml táptalajra 5 ml-t használva. A tenyészetet ezután 48 órán át növekedni hagyjuk forgórázó berendezésben (250 ford/perc, 2,6 cm lökethossz) k!b. 28 C°-on. A 48 órás növekedési periódus végén minden egyes rázólombikba 5 mg 7(S)-klór-7^dezoxilinkomicin-JiMrokloridot adagolunk és a fermentációt további 24 órán át folytatjuk. A lombikok tartalmát ezután összeöntjük (kb. 10 liter), diatómaíöldet adunk hozzá, majd a fermentlevet és a mioéliuimot szűréssel elválasztjuk. A szűrőlepényt 1 liter vízzel mossuk és a mosóvizet hozzáadjuk a tiszta fermentléhez. Az így kapott tiszta fermentlevet átvezetjük Amberlite XAD-,2 gyantán (Rohm and Haas Co., Philadelphia, Penn. 19105). Az oszlopot úgy alakítjuk ki, hogy nedvesen betoltunk 350 g gyantát és azt hagyjuk leülepedni a gravitáció hatására. Az oszlop „ágytérfogata" 500 ml. A tiszta fermentlevet az oszlop tetején adagoljuk be és kb. az agytérfogat 4%-ának megfelelő 7