158918. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kortikoszteroidok mikrobiológiai C-1,2-dehidrogénezése hatásfokának javítására

5 158918 6 Ez utóbbi hátrányos és a kívántt céllal éppen ellenkező irányiban ható tényezők visszaszorítáaai volt szükséges, ahhoz, hogy a tenyészet 01,2--öehidtriogenáz-aktivitását ,a növekedési svakban elélhető imaxiimális. éritékre növeljük anélkül, hogy ssz átalakításit megnövékediett sebességű melTékreaikciók kis érnék. Ez a ttalálimány érteimében oly módon tortának, hogy az átalakitáiihcz alkalma.aaaidó mikroorganizmusok tenyésztését báranery erre alkalmas táptalajon, addig folytatjuk, míg ,a növekedés leáll, vagyis iá táptalaj kimerül és a baktériumtenyész©'; nyugalmi, stacioner szalkba jut. Ekkor egy csupán 3—6 órai másodfiagos növekedést idézünk elő, erre a célra a tenyészethez olyan mennyiségű, az eredeti táptalajban is alkalmazott C és N f onrásit «dunk, 'melyet a baktériumok a 3—6 óra alatt fel is •h'aszinákiak. A leállt növekedés másodlagos megindulásának biztosítására a friss tápanyagokat a tenyészet térfogatára számított 5—20%-nyi víziben adjuk be és így a kimterült táptalaj e kismértékű (hígításával 3—6 órára biztosítjuk a baíktériuimnövekedé:s „életterét". Ekkor adjuk a t'snyésizetlhez az iniduktor-SiZieroidot, célszerűen a napanyagok vizes oldatában vagy külön szerves oldószerben feIo!d|va és ezáltal a másodlagos növekedés megindításával egyidősben megindíthatjuk az 1,2-jdéhildrogenáz indukciót is. Az .induktív enzim kialakulása az újra meginduló anyagosere során gyonsan és nagy hatásfokkal (megy végbe, ugyanakkor azonban 3—6 óra múlva, az indukció befejezi tekcr a tenyészet ismét nyugalmi szakba jut* és a nagy átalakítóképesség ímeílett újsra alacsony redukciós és alacsony bontási készséggel rendelkezik. A tenyészet 1,2-dehidrogenáz-tartalmának mennyiségi meghatározására és taz aktivitás növekedés követés éne oly módszer alkalmaztunk, amely az emziim és hídrokortizon jelenlétében a diklóirfeno 1-ándofenol színitelenedési sébességénak mérésén'alapul [Sah, C. J; Bennett, R. E., Biochim.. Biophis. A. 56, 584 (1962)] és egységként a percenkénti 0,01 extinkció^cöölkkenést választja. A sejtszámra fajlagosíltott eraziramennyiség e módsziaríel mérve az eddig ismert eljárásoknál: 25—40 egysjégnek, a találmány szerinti eljárással végzett indukció esetén pedlig 1.20'— 150 "egységnek adódott. Az enzaítiaikitiviitás az eiőtényésztéstől függően a, 3—5. árában éri el maximumát. Célszerűéin 4 órás indukciós időt választíhatunk és az ehhez szüksiége's másodlagos növekedést úgy ibiizí'tosMjhatjufc, hogy 24 óra alatt nyugalmi szakot elér.t tenyészethez egy hatod térfogiatmyi viaöt és a rendes növekedés biztosításához iszü[teséges tenyésztő táptalaj C- és, N^fotrás tartalmának V»—Wát — de (min<d<ew esetiben csak a másodlagos növekedés Borán, gyakorlatilag itefijieseíi felhasználható [mennyiségét adjuk. Indüktor-sz terűidként hidrokortizant, prednizolont, .andfosztendibnit istib. adagolhatunk vizes, alkoholos,, vagy aoetonos oldatban, 0,1—0,4 m|g/'ml ikoncentráció eléréséhez szükséges menynyis égben. Az inplukció idejére előidézett 'másodlagos növekedés révén elért nagy enziini-akltivitás gyorsan induló és rövidebb idő alalit lezajló átalakítást eredményez, a imeaékterméikíképződés és a szteroidleihontás sebe:=í;ége nem amieiikiedik, a rneii ék termékmennyiség és szteroid-ívesizyeség az átalakítási idő rövidülésével arányosan csökken. Az átalakítás hatásfoka, eléri a 98—99%-ot. Az átalakító tenyészet magas enzim-aktivitása különösen jélenitős olyan esetekiben, amikor az átalakítandó szteroidként valamely, az eljárást közvetlenül megelőző mikrobiológiai műveletben keletkező terméket, tehát nem izolált, egységes anyis.got aikaülmazunk, mint amikor a hidrokoritizont pl. Reichsitein-féle S vegyületből a ll/J-ihelyzetben történő mikrobiológiai hidroxiL-éüemizéssel állítjuk elő és. a kapott termieket közvetlenül vetíjük alá 1,2-dshidrogéinezésnek. Az átalakítás során az alkalmazott törzstől függően hidrokortizon mellett más helyzetben hijdiroxilezet't Reictojein-S származék — 'mint pl. a 11a-oxi-Reichstein-S — is keletkeznek. A korábbi eljár ás okkal indukált tenyészetek az ilyen melléktermékek C-l,2-deh.idrogénezését igen rossz hEitásfokfcai végzik, ezzel szemben (a. találmány szerinti .módon a, másodlagos növekedés mellett végzett indukció e termékek átalakulását is biztosítja. A találmány a fentiek értelmében tehát oly eljárás koriikoszteroidok 1,2-ftíiéhiidirogénezéséríe Oorynebacterium-fiajóikkal, a tenyésztésit követő és az. átalakítást megelőző enzim-indukció alkalmazásával, amelyet az jellemez, hogy <a szteroid 1,2-déhidrogenáz indukcióját 0,1—0,4 img/ml andirosztán, vagy pregnán sorbali sateroid vegyület adagoláséval csak a 'baktériumok szaporodásának leállása után, a nyugalmi szakban kezdjük meg, ugyanakkor a táptalaj C- és/vagy N-f orrást biztosító komponensét a /tenyészet szaporításához, felhasznált mennyiség Vs—Vio részének megfelelő mennyiségben beadagolva «2 indukció idejére másodlagos növekedést idézünk elő, majd az így nyert 'megnövelt aktivitású !benyészetihez a C-l,2^helyzeífoén telített kortikoszteroidot adagolunk és ezzel dehidrogénezése után a kapott terméket ismert módon kinyerjük. A C-l,3-diehMirogéneZ'és Ihatáisfoka a találmány szerintii eljárás esetén még tovább növielhetőj, ha a sziámi to tt mennyiségű táptalajkomíponensék adagolása és a másodlagos növekedés előidézése mellett végEiciít Mdiujkció után az átalakításkor a tenyésziét Kediíkáló képességét íhidriogén-iakceiptor anyag, pit 2-nietil-l,-4-<rKaftokm0!n, vagy diklóffftió'l-iiridofenol .ml-^enikéttt néhány gamimányi (mennyiségeinek adagolásával tovább csökkeínltjük. 10 15 20 25 to 35 40 45 50 55 60 3