158738. lajstromszámú szabadalom • Eljárás anyarozs alkaloidok fermentációs előállítására
5 158738 mázhatok. Faktor B adalékként további tisztítás, vagy az anyag szilárd formáiban történő kinyerése nélkül megfelel az anaerob B12 vitamin fermentáció feldolgozásakor képződő Faktor B-fcen dús melléktermék. A fenti adalékok nemcsak a vízben oldódó alkaloidok, hanem a peptidalkaloidok szintézisét is fokozzák. Ezt mutatja, hogy azonos mértékű alkaloidszint növekedés érhető el mind a vízoldékony klavinalkaloidokat termelő, mind pedig a jellemzően ergometrint-ergotoxint termelő törzseknél is. Az utóbbi esetben kvantitatív elúciós rétegkromatográfiával vizsgálva külön az egyes alkaloidfajták változását, megállapíthattuk, hogy az ergometónre jellemző R/-értéknél leoldható alkaloid és az ergotoxin-csoport komponenseire jellemző R/-értéfcnél visszanyert alkaloidok mennyisége arányosan nő. Végül alkaloidszínt növekedést kaptunk olyan,- szaprofita körülmények között termelést mutató törzts^ nél is, amelynél a kromatogram domináló foltja az ergotamin helyén jelentkezett. A találmány szerinti eljárás szemléltetésére aa alábbi példák szolgálnak. 1. példa: Claviceps purpurea OY—179 rázótenyészettel oltjuk az alábbi táptalajt: 100 g szacharóz, 2,0 g borostyánkősav, 1:0,0 g glicin, 0,25 g KH2P0 4 , 0,25 g Mg,S0 4 , 0,002 g gibberellin A 3 literenként. Ammóniumihidroxiddal a pH-t 5,2-re állítjuk. A fermentációt 6 liter térfogatban, keveréssel és levegőztetéssel 7 napig folytatjuk; a kinyert centrifuganedves micélium mennyisége 416 g. Ezlt a micéliumot acetonnal extraháljuk, a hatóanyagot toluollal 1%-os vizes borkősavoldatba rázzuk át, majd a vizes oldatból kloroform és izopropanol 4 :1 arányú elegyével extraihárjuk és rétegkromatográfiával vizsgáljuk. A kromatogramot inaktív alumíniumoxid-rétegen 1,5% etanolt tartalmazó kloroformmal 16 órán át fejlesztjük, az alkaloidfoltokat fluoreszcencia alapján jelöljük ki. A megfelelő területről az alkaloidot 50% metanolt tartalmazó borfcősavoldattal eluáljük, a tartalmat az illető alkaloid ibolyántúli elnyelési maximumán mért extiinkeió alapján számítjuk ki. Az ergotoxin csoportra jellemző 0,51—0,39 R/^értékű alkaloidok 6 liter fermentációs léből kinyerhető számított mennyisége 480 mg. A micélium-mennyiség 25%-kal, az alkaloid 20%kal magasabb, mint az összehasonlításul gibberellin A3 adalék nélkül lefolytatott fermentáció esetében. 2. példa: Claviceps purpurea Ix 13—26 törzs 200 liter oltótenyészetével oltjuk be az alábbi anyagokat tartalmazó 3 m9 táptalajt: 240 kg szacharóz, 15 kg borostyánkősav, 15 kg citromsav, 0,75 kg KH2 ,P0 4 , 0,75 kg MgS0 4 , 6,0 kg NH 4 N0 3 , 3 kg Ca!(N03 ), 2,60 kg NaCl. A táptalaj pH-értékét NH4 OHndal 5,6-ra állítjuk, majd 0,3 g Faktor B-t tartalmazó vizes koncentrátUimot adagolunk hozzá. A fermentációt keveréssel és levegőztetéssel 23—24 C°^on 7 napig folytatjuk. Leálláskor a fermentlé szárazanyagtaritalma 42 g/liter, összalkaloidtartalma van Urk-réagenssel mérve és ergotaminban kifejezve 2100 mg/liter, az 1. példa szerinti rétegkromatográfiával az ergometrinre jellemző 0,08 R/^értéknél mént alkaloidszint 320 mg/liter, az ergotoxincsoportra jellemző R/-értékű termék szintje 240 mg/liter. A párhuzamosan végzett, Faktor B adalék nélküli fermentáció leállási szárazanyagtartalma 32—36 g/liter, összailkalaidtartalma 600—800 ing/ liter, az elválasztott frakciók 80—120 mg/liter ergometrint, ill. 80—140 mg/liter ergotoxincsoportbeli alkaloidot tartalmaztak. 3. példa: Clavioeps fusiformis B 35 rázótenyészetévei 200 ml alábbi összetételű táptalajt oltunk be: 50 g glükóz, 50 g m'annit, 10 g borostyánkősav. literenként, valamint a 2. példa szerinti szervetlen sók. A táptalajhoz 1 mg/liter B]2 vitamint adunk, a tenyészetet 8 napig szobahőmérsékleten rázatjuk, a leállásikor mérhető összalkaloid-érték 4800 gamma/ml, van Urk-reagenssel mérve és elimoklavinban kifejezve. A B12 Jadalék nélküli párhuzamos tenyészetben 2600 gamma/ml összalkaloid volt kimutatható. 4. példa: Parazita körülmények között ergotamint termelő Claviceps purpurea törzsnek az 1. példa szerinti táptalajon szaporított rázott tenyészetéhez 0,1 mg/liter Faktor B-t adagolunk. A 10. napon a van Urk-reagens!sel mérhető alkaloidszint ergotaminban kifejezve 170 gamma/ml, a Faktor B adalék nélküli tenyészetben elért értéknek 2,6-sZorosa. Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás anyarozs^alkaloidok fermentációs előállítására Clavioeps törzsek cukrot, nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmazó táptalajon történő szaporítása során, azzal jellemezve, hogy a táptalajhoz növekedést serkentő anabolikumokat, elsősoriban B^ivitaminit vagy Behatása ikobalamin^származéfcokat adagolunk 0,01—10,0 gamma/Imi végkoncentrációt biztosító mennyiségben. 15 20 25 30 35 40 45 S0 55 60 3
