158344. lajstromszámú szabadalom • Eljárás W847-antibiotikumok előállítására
9 158344 10 •^komplexet ezektől a fontos makrolid anltibiotikumoktól kovaisavgél GF lemezeken (Analtech Inc., Wilmington, Delaware) végzett vékony réteges kromatográfiával különböztettük meg. A zónákat a következő két módszerrel mutattuk ki: 1. A lemezeket megpermetéztük 1 :1 térfogatarányú tömény kénsav-metanol eleggyel, és előhívtuk néhány percre 105 C°-ra hevítve. A szerves anyag zónái színes területekként jelennek meg a fehér háttéren. 2. A lemezeket érintkezésbe hoztuk S. aureusszal beoltott agarréteggel. Whatman 1. sz. papírt helyeztünk a beoltott agarréteg és a lemez közé, nehogy kovaisavgél tapadjon az agárhoz. A papírt és a kovasavgélt 15 perc múlva eltávolítottuk. Az agarlemezt 37 C°-on éjjelen át inkubáltuk, és az inhibíciós zónákat értékeltük. Ezeknek a kísérleteknek az eredményeit a 4. táblázatban foglaltuk össze. Ezenkívül a W847 antibiotikum-komplex és elkülönített frakciói alább ismertetett fizikai, kémiai és biológiai tulajdonságainak az ismert makrolidoknak az irodalomban közölt tulajdonságaival való összehasonlítása által a W847 antibiotikum-komplex és összetevői megkülönböztethetők minden ismert makrolid antibiotikumtól. A W847 antibiotikum-komplex pozitív színreakciót ad a nirthidrin-, keményítő4íáliumjodid- és biuret-próbákban és negatív színreakciót az ón(II)klorid-, Molisch- és Sakaguchipróbákban. A komplex gyakorlatilag transzparens az ultraibolya tartományban. A W847 antibiotikum-komplex aktivitása nem változik szignifikánsan, ha oldatát 100 C°-on 30 percre 2 és 10 pH között állni hagyjuk (a stabilitás vizsgálatára az antibiotikumot etanolban oldottuk, pufferoldattal hígítottuk, és S. aureus és Escherichia coli ellen vizsgáltuk). A komplex aktivitása nem csökkent, amikor a pufferolt oldatban (optimális pH minden enzimre) 37 C°-on 24 óráig terjedő időtartamokig tripszinnel, kimotripszinnel, pepszinnel, oc-amilázzal vagy penicillinázzal kezeltük. A W847 antibiotikumkomplex oldható a legtöbb poláris oldószerben, például etilacetátban, metanolban, etanolban és acetonban. 3. A W847 antibiotikum összetevők elválasztása. Kromatográfiai vizsgálat 60 : 40 térfogatarányú kloroform-metanol oldószerrendszerben és azt követő vékonyréteges kovasavgéllemezes bioautbgráfia Sarcina luteával beoltott agáron arra mutat, hqgy a W 847 antibiotikum-koplex legalább négy antibiotikum-összetevőből áll; ezek a továbbiakban W 847 antibiotikum A, B, Cx és C 2 frakcióknak (vagy W 847—A antibiotikumnak, W '847—B antibiotikumnak, W 847—Cx antibiotikumnak és W847—C2 antibiotikumnak) fogjuk nevezni. Ezeknek a frakciók-' nak az Rf értékei a fent megadott összetételű oldószerrendszerben 0,19 (A frakció), 0,38 (B frakció), 0,52 (Cx frakció), illetve 0,65 (C 2 frakció). Ezek a frakciók a következőképpen választhatók el egymástól: A W847 antibiotikumkomplexet feloldjuk olyan acetonban, amelybe előzőleg kovasavat kevertünk. Az acetont elpárologtatjuk, és a száraz keveréket felvisszük egy kovasavoszlop tetejére. Az oszlopot 60 : 40 térfogatarányú kloroform-metanol eleggyel eluáljuk, és a frakciókat összegyűjtjük. Az oszlopot kimérjük, minden frakciót lemezen kipróbálva S. aureus és E. coli ellen. Az aktív frakciókat vékonyréteges kovasavgéllemezeken kromatogríafáljuk, másfél óra hosszat futtatva abban az oldószerrendszerben, amelyet az oszlopon is használtunk. Az antibiotikum frakciók elosztását a fentebb leírt két módszer szerint tesszük láthatóvá. A frakciókat kromatográfiai elosztásuk szerint egyesítjük, és bepároljuk. Ezzel a módszerrel, az egyesített aktív frakciókat metanolban oldva és kb. 10 térfogat etiléterrel kicsapva, a C2 frakciót fehér por alakú hidroklorídja alakjában elkülönítjük. A C2 -hidroklorid frakció titere ebben a stádiumban kb. 1100 /tg/mg-nek felel meg. Kromatografálás közben a W847—C2 bázist az oldószerhez adott kevés sósavval reagáltatva átalakítjuk a hidrokloridjává. Ez a hidroklorid, mint várható is, nem oldódik számbajövő mértékben etiléterben, ennélfogva azt hozzáadva kicsapható. A W847—C2 szabad bázis alakjának előállítására híg lúgot, például 0,1 n nátrinlúgot adunk a hidroklorid vizes oldatához kb. 8,5— 9,5 pH eléréséig, majd a szabad bázist szűréssel elválasztjuk a vizes szuszpenziótól. Az oszlopról összegyűjtött későbbi frakciókat egyesítve és szárazra párolva fehér W847 antibiotikum Q frakciót kapunk. Ebben a stádiumban a W847—Q por titere kb. 880 /tg/mg-nek bizonyul a fentebb leírt 'hengeres csészés próbában. A fent ismertetett bioautográfikus eljárást és oldószerrendszerként 60 :40 térfogatarányú kloroform-etanol elegyet alkalmazva az elkülönített W847—Q antibiotikumnak széles spektrumú baktériumellenes hatása van in vitro a következő Gram-pozitív és Gram-negatív mikroorganizmusokkal szemben: Bacillus subtilis ATOC 6633 Sarcina lutea ATCC 9341 Staphylococcus aureus ATCC 6538P Pseudomonas aeruginosa ATGC 8689. A további aktív frakciók a kovasavoszlopról egyesíthetők, és további elválasztás érhető el Florisil (magnéziumszilikát) oszlopon végzett kromatografálással a következőképpen: Az oszlop előkészítésére a Florisilt 100 C°-on 16 óra hosszat aktiváljuk, hexánnal rögzítjük, és a keletkezett zagyot üveghengerbe öntjük. Az osz-10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
