158342. lajstromszámú szabadalom • Eljárás trienin antibiotikum előállítására

158342 4 Az antibiotikum termelésében hasznosítható szémforrások igen változatosak, idetartoznak például Cukrok (pl. glükóz, laktóz, maltóz, szacharóz), dextrin, különféle eredetű keményítők, glicerin és más polialkoholok, inozit és állati és növényi zsírok, továbbá észtereik. A tenyésztést és a trienin termelését serkentő szerves nitrogénforrások például a szójaibabliszt, gyapotmagliszt és más növényi lisztek (adott esetben részben vagy egészen zsírtalanítva), húslisztek vagy állati belsőségek, különféle peptonok, kazein-, szójababliszt- és élesztőhidrolizátumok, laktalbumin, búzasikér, szeszmoslék, kukoricalekvár, karbamid és aminosavak. Szervetlen sók, mint a kloridok, nitrátok, szulfátok, karbonátok és foszfátok (nátrium-, ammónium- és kalcium-kationnal) kellő koncentrációban alkalmazandók. A táptalajnak ezenkívül fémek, például magnézium, vas, réz, mangán, cink és kobalt nyomait kell tartalmaznia. A pH-nak a fermentáció során való beállítására célszerű pufferoló szereket, például kalciumkarbonátot adni a keverékhez. Szükség esetén haibzásgátló szer hozzáadása ajánlatos. A leírt körülményeik között kb. 25 C° fermentációs hőmérsékleten 1—5 nap alatt érhető el maximális trienin termelés fermentorban. A fermentációhoz használt oltóanyag spórák szuszpenziója vagy liofilizált micélium lehet, iners szubsztrátummal liofilizálva. Rendszerint egy vagy több folyékony táptalajos szaporító műveletet iktatunk közbe a termelő fermentáció előtt. A trienin elkülönítése A trienin kémiai és fizikai-kémiai tulajdonságai " A trienin amorf halványsárga por 163—165° olvadásponttal és 180 C° bomlásponttal. Oldható metilalkoholban, piridinben, dimetilformamidban, de oldhatatlan a legtöbb más szerves oldószerben. A trienin pozitív Tollens és negatív Fehling reakciót ad. Ninhidrin reakciója csak savas hidrolízis után pozitív. Savas hidrolizátumában papírkromatografálással nem sikerült aminosavakat kimutatni. Elemanalízisének eredménye a következő: C 54,75, H 7,99, N 1,17, O 36,09% (a különbségből). Nitrogéntartalma alapján a legkisebb molekulasúlya kb. 1400. Nem-vizes titrálások a fenti molekulasúly tartományban levő sav és bázis neutralizációs egyenértékeket mutatnak. Ezek savra 1500, bázisra 1580. A trienin infravörös színképe (1. ábra) jellegzetes abszorpciós vonalakat mutat 3,0, 3,42, 6,29, 6,90, 7,05, 8,12, 8,70, 10,07 és 11,80 /i-nál. Az infravörös színkép alapján megállapítható, hogy a trienin ionizált karboxilcsoportokat és hidroxilcsoportokat tartalmaz. A 10,07-es abszorpció trién-alakzat következménye. A laktoncsoport okozta jellegzetes abszorpciós vonal, 5,8 ft nincs jelen. A trienin infravörös színképe és nagy molekulasúlya arra enged következtetni, hogy nem jellegzetes polién antibiotikum. A trienin ultraibolya színképe metanolban (2. ábra) egy trién jellegzetes abszorpciós görbéjét mutatja. Abszorpciók láthatók 257, 267 és 278 m/t-nál, 332, 407, illetve 322 Ef^m

értékkel. A 267 csúcsból 1400 molekulasúllyal számított £ mól 56 980, ami nagyon közel áll az irodalomban az oktatriénre megadott 53 000 értékhez. Eszerint az ultraibolya adatokból számított minimális molekulasúly jól egyezik az elemanalízisből számítottal. "Ultraoentrifugális méréseket végeztünk J. Kirschbaum és A. Aszalós szerint [J. Pharm. Sei. 56, 410—41,1 (1967)], Arohibald-féle szedimentációs egyensúlyi optikát használva 42 000 percenkénti fordulatszámnál és 75° Schlieren-fázisszögnél 20 C°-on. Foszifátpufferben 2 komponenst találtunk 1300, illetve 3200 molekulasúllyal. Metilalkoholban csak egy komponens mutatkozott 1430 molekulasúllyal. A 3200 molekulasúlyú második komponens foszfátpufferban feltehetően dimerképződés következménye. Eszerint az ultracentrifugás mérések alátámasztják az elemanalízisből és az ultraibolya adatokból kiszámított molekulasúlyt. Többféle kromatografikus rendszert használtunk a trienin elkülönítése során a homogenitás elérésére. 4:1 :5 arányú butanol-ecetsav-víz oldószerrendszerben papíron a trienin Rf értéke 0,55. Eastman ITLiC kromatogramon metanol oldószerrel a trienin Rf értéke 0,0. Bázisokkal ismert módon reagáltatva a trienin sókat alkot. Ilyen sók például fémsók, mint a nátrium, kálium, kalcium stb. sói, ammóniumsók és aminsók, például a prokainsó. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 A trienin jo hozammal különíthető el a nyers 40 vagy centrifugált fermentléből 5 és 8 pH között, ahol a legnagyobb a stabilitása. Savasabb pH esetén némi veszteség mutatkozik, a veszteség nő a pH csökkenésével. Minthogy az aktív terméket eredetileg a 45 fermentleben finoman diszpergált, oldhatatlan alakban nyerjük, a fermentlének a fermentáció pH értékénél való szűrésekor az aktivitás a micéliummal együtt marad. A szűrést előnyösen szűrést elősegítő anyaggal, például Hyfloval vé- 50 gezzük. A trienin kinyerhető a szűrőlepényből a nedves szűrőlepénynek poláris oldószerrel, például izopropilalkohollal való extrahálásával. A kapott kivonatot koncentráljuk, és a koncentrátumot az oldószerben néhány órára kb. 5 55 C°-on. szuszpendáljuk. A képződő csapadékot ezután kiszűrjük, és megszárítjuk. További tisztítás lehetséges ennek a terméknek újabb extrahálásával, ellenáramú megosztással és többszöri lecsapással. 60 2