158336. lajstromszámú szabadalom • Eljárás (-) (cisz-1,2-epoxipropil)-foszfonsav előállítására mikrobiológiai úton

65 158336 66 amelynek pH-crtéke sterilezés előtt 7,2 volt, hozzáadtunk 1 ml oltóanyagot, amelyet úgy készítettünk, hogy a fenti tápoldat 10 ml-ébe szuszpendáltuk a S. viridochromogenes MA— —2867 (NRfRL—3413) ferde agaros kultúráját. A beoltott tápoldatot egy 250 ml-es terelőlapos Erlenmeyer-lombikban két napig inkübáltuk 28 C°-o.n körrázóberendezésben, és a kapott fermentációs lé 10 ml-es részletével beoltottuk egy kétliteres terelőlapos Erlenmeyer-lombikban a fent leírt összetételű steril vizes tápoldat 500 ml-es részletét. Ezt a beoltott tápoldatot azután két napig inkübáltuk 28 C°-on körrázóberendezésben, és a kapott lével beoltottuk egy 190 l-es rozsdamentes acél fermentálótartályban a fent leírt összetételű steril tápoldat 100 literes részletét. Ezt a beoltott tápoldatot 28 C°-on rázás mellett 40 óra hosszat inkübáltuk, miközben a fermentációs tápoldaton percenkint kb. '90 1 levegőt vezetünk át. A fermentáció alatt csekély mennyiségű Poliglikol 2000 szert adagoltunk a fermentáló tápoldat habzásának gátlására. fagyasztásos szárítással kapott szárazanyagokat vízben feloldottuk és újból megállapítottuk hatóanyagvizsgálattal az egyes frakciók aktivitását. Az első két 100 ml-es vizes eluátumfrak-5 ciót egyesítve kaptuk a 62—2. sz. mintát, és az első három metanolos eluátumfrakció egyesítésével a 62—3. sz. mintát. A 62—2. sz. minta, amelynek teljes térfogata 45 ml, összes szárazanyag-tartalma pedig 30 mg/ml volt, a Prote-1D us vulgaris-szal végzett standard hatóanyagvizsgálat során 1:200 hígításban mutatott 25 mm átmérőjű inhibiciós övezetet. A 62—3. sz. minta, melynek teljes térfogata 27 ml, összes szárazanyagtartalma pedig 47 mg/ml volt, 1:400 15 hígításban adott 25 mm átmérőjű inhibiciós zónát. Az 1. példában leírt eljárással meghatároztuk a 62—2. sz. mintának (1), valamint az egyenlő 20 mennyiségű nátrium (—) (cisz-l,2-epoxipropil)foszfonáttal kevert 62—2. sz. mintának (2) papircsík-kromatográfiás mozgékonyságát. A következő eredményekhez jutottunk: A kapott fermentációs lé 43 liternyi részleté- 25 vei mint oltóanyaggal beoltottunk azután egy 760 l-es rozsdamentes acél fermentálótartályban 510 liter steril vizes tápoildatot, amely 2% paradicsompürét és 2% zablisztet tartalmazott. A beoltott tápoldatot 28 C°-on inkübáltuk 90 óra 30 hosszat rázás mellett, miközben percenkint 300 1 levegőt vezettünk át a fermentáló tápoldaton. A kapott fermentációs lé szűrt mintája a Proteus vulgaris-szal (MB—838) végzett, az előzőekben már leírt standard hatóanyagvizsgálati 35 módszerrel 33 mm átmérőjű inhibiciós zónát adott. E tápoldat egy részletét 48 óra múlva eltávolítottuk a fermentálótartályból és szűrtük. A 40 szűrt lé a Proteus vulgaris MB—838-cal végzett standard hatóanyagvizsgálat során 25 mm átmérőjű inhibiciós zónát adott. A szűrt tápoldat 10,5 literes részletét híg nátriumhidroxid oldattal 8,5 pH értékre állítottuk be és adszorbeál- 45 tattuk egy olyan oszlopon, amely 210 ml klorid alakú, erősen bázisos anioncserélő műgyantát tartalmazott, amely sztirol-divinilbenzol polimer rácshoz kötött kvaterner ammónium cserélőcsoportokból állott (Dowex 1x2). A kapott mű- 50 gyanta-adszorbátumot 300 ml vízzel mostuk, azután eluáltuk először 1 liter 3%-os vizes ammjóniumHhidrogén-karbonát-oldattal, majd 1 liter, 70%-os metanollal készült 3%-os aimmónium-hidrogén-karbonát oldattal. Az eluátu- 55 mokat 100 ml-es frakciónkint gyűjtöttük és mindegyik frakciót megvizsgáltuk hatóanyagtartalomra. A Proteus vulgaris MB—838-cal végzett standard hatóanyagvizsgálat szerint az aktivitás 20-a a vizes eluátumban, 30%-a pedig 60 a metanolos eluátumban volt jelen. A vizes eluátumfrakciókat közvetlenül vetettük fagyasztásos szárítás alá, a metanolos eluátumfrakciókat viszont előbb vákuumban bepároltuk s azután vetettük őket fagyasztásos szárítás alá. A 55 Biográfiához használt mikroorganizmus Rf érték a „K" „C" oldószerrendszeriben (1) Proteus vulgaris MB—838 0,42 079 (2) Proteus vulgaris MB—8:38 0,44 0,78 Az 1. példában leírt eljárásokkal egymás melletti papírcsík-elektroforézises vizsgálatokat is végeztünk a fent említett két mintával. A 62—2. sz. minta mozgása 13,0 cm, a nátrium (—) (cisz-l,2-ep0xiprapil^foszfonáttal kevert 62—2. sz. minta mozgása viszont 12,4 cm volt. A 62—2. sz. minta •— egyidejűleg a kalcium (—) (riszál ,!2-epoxipropil)-foszfonáttal végzett — antibakteriális és kereszt-rezisztenciás vizsgálataikban az alábbi spektrumokat kaptuk: Inhibiciós zóna átmérője mm (korong 7 mm) Vizsgálatra használt Kalcium (—) (cisz-1,2-mikroorganizmus -epoxipropil)-<foszfonát 62—2.

sz. 400 Mg/ml minta Escherichia coli MB—J60 26 19 Bacillus sp MB--833 7 7 Proteus vulgaris MB—1012 39 36 Pseudomonas aeruginosa MB—979 8 •7 Serratia marcescens MB—252 17 13 Staphylococcus aureus MB—108 18 12 33