158174. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a 19 042 RP enziminhibitor és összetevői előállítására
13 158174 14 extraháljuk. Különösen előnyösen használható e célra a n-butanol. A 19 042 RP a szerves oldatokból az oldatnák 5 és 25 C° között csökkentett nyomás alatt való koncentrálásával, majd az enziiminhibitort rosszul oldó oldószer-rel, például petroléterrel, cifelohexánnal vagy aoetonnal, —15 és +10 C° közötti hőmérsékleten való kicsíapással 'különíthető el. Ügy is eljárhatunk, hogy a 19 402 RP-t a szűreddkből egy 3—7, előnyösen 5 pH-nál egyensúlyba hozott karbansav-itípusú műgyantával adsaoiibeáltatjuk, majd 0,1—5 n (metanol os vagy etanolos bid!rogónlklorid~oldattal eluáijuk, erre a célina előnyösen 0,5 n hidrogénkloridoldat használható 70%-os metanolban. Az aktív eluensfrakciókat közömbösítjük, az alkohol elűzésére csökkantett nyomás alatt koncentráljuk, és a fent leírt körülményék között extraháljuk. . Ezután a nyeirs 19 042 RP enziminhibitor a következő módszerek szerint tisztítható: a) pikiráttá alakítjuk, ezt megtisztítjuk, és ebből a sóból vizes-alkoholos sósavval felszabadítjuk a tisztított 19 042 RP-t; b) híg savas oldatban, előnyösian híg sósavban dextrán vagy poliaikrilamid gélen krornatografáljuk; . • c) vizes vagy vizes-alkoholos oldatban előzőleg kénsavval vagy sósavval kezelt aluimíniumoxidan kiramiaitografáljuk. Ha az alumíniumoxidot kénsavval kezeltük, a termék szulfát és hidróklorid keverékeiként keletkezik. Ha az alumíniumoxidot sósavval kezeltük, akkor a termék hidrókloridok keveré-, keként keletkezik. A találmány értelmében a 19 402 RP enziminhibitor vizes vagy vizes-aljkohoios oldatban dextrán vagy poliakrilamid gélen vagy alumíniumoxidon való kramiatografálással szétválasztható a 21 052 RP és 21 053 RP fő összetevőire. A következő példák szemléltetik korlátozás szándéka nélkül a találmány gyakorlati végrehajtását. A termékek »aktivitását antitripszinegységekben adjuk meg. Egy antitripszin egység (E) az enziminhibitoirnak az a mennyisége, amely szükséges 1,5 //.g a kristályos tripszin kazeinqlitikus hatásának 7,6 pH-nál és 37 C°-on 50%-kal .való csökkentésére. A vizsgálat körülményei azonosak a Kunitz [J. Gen. Physiol. 30, 291 (1947)] által Leírtakkal. 1. példa: Egy 170 literes fermentoirba betiöltjük a következő anyagokat: peptan 600 g húskivonat 600 g glukózhidrát 1200 g nátriumklorid 600 g agiarpor • . 240 g vízzel kiegészítve 110 literre. A keverék pH-ját 100,ml tömény inátranlúggal (d = l,33) 7,0-ra állítjuk be. A táptalajt 122 C°-os gőznek 40 percig tartó bevezetésével ste-10 15 20 25 30 40 4Ö 50 55 60 65 riiizáljuk. Lehűlés után a táptalaj térfogata 120 liter és pH-ja 6,6. A táptalajt beoltjuk 200 ml rázott Erlenmeyer-loimbikban készült Streptomyces hygroscopicus DS 10 408 tenyészettel. A fermentációt 27 C°-on 24 ória hosszat folytatjuk keverés és steril levegővel való levegőztetés közben; ekkor alkalmas a termelő tenyészet beoiíására. A termelő tenyésztést a következő anyagokkal töltött 800 literes fermentorban végezzük. pepton kalciumkarbonát agarpor vízzel kiegészítve 16 kg 1 kg 0,8 kg 355 literre. A keverék pH-j árnak 770 mi töimény nátronlúggal (d—1,33) 7,0-Hiia való 'beállítása után a táptalajt 122 C°-os gőznek 40 percig tartó bevezetésével sterilizáljuk. Lehűlés után hozzáadunk 6 kg glukózhidrátot tartalmazó 15 liter steril vizes oldatot. Ekkor a táptalaj térfogata 400 Iter, és pH-ja 6,8. Ezt beoltjuk a 170 literes fermentorban készült 40 liter oltótenyészettel. A tenyésztést 27 C°-on 33 óra hosszat folytatjuk, percenként 205 fordulatú keverővel keverve, és óránként 15 ni3 steril levegővel levegőztetve. A táptalaj pH-ja akkor 8,0, és a fermentlé térfogata 400 liter. Az anititripszin aktivitás vizsgálata azt mutatja, hogy a fermentlé titere 735 E/ml. 35 2. példa: Az 1. példában leírt körülmények között készült és 620 E/ml titerű 400 liter f erimentlével megtoltunk egy keverős tartályt. A íermentié pH-ját 1500 ml 5 n sósavval beállítjuk 3 értékre. Hozzáadunk 20 kg szűrést elősegítő anyagot. A keveréket szűrőpirésen leszűrjük, és a szűrőliepényt 75' liter vízzel mossuk. így 400 liter 240 E/;ml titerű szűiredéket kapunk. A szűredéket csökkentett nyomás alatt 30 C°~ on ötödrészére koncentráljuk. 80 Iter koncentrátumot kapunk 2855 E/ml titeirrel. Ehhez a koncentrátumhoz 40 kg animóniumszulfátot adunk, és a pH-ját 550 ml 5 n sősiavval 3 értékre állítjuk be. A keveréket 5 C°-ra hűtjük, és 3 ízben 40 liter butanollál extraháljuk. A ibutanoilos kivonatókat egyesítjük, majd csökkentett nyomás alatt 30 Ca -on koncentráljuk. Így 10 liter butanolos kivonatot 'kapunk. Szűréssel eltávolítjuk a főleg ammóniumszulfátíból álló oldhatatlan részt, majd a víztiszta koncentrátumhoz 25 C°-on 60 liter aoetont adunk. A" csapadékot mossuk, centrifugáljuk, majd 20 torr nyomás alatt 30 C°-o.n megszárítjuk. Így 668 g 255 E/mg titerű terméket kapunk. T
