158035. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fajspecifikus gömőkor diagnosztikum előállítására

158035 vagy ioncsere útján való sómentesítése és bepárlás, vagy pedig a poliszaccharid kicsapására alkalmas vízzel elegyedő szerves oldószer, pl. etanol hozzáadásával való kicsapás útján történhet. Ez utóbbi módszer általában előnyösebb, mert az így száraz por alakjában kapott poliszaccharid jól eltartható, könnyen standardizálható és pontosan" mérhető, ami a szerológiai vagy allergiás diagnosztikai készítmények előállítását megkönnyíti. A szerológiai készítmé- -nyéknek vagy- diagnosztikai reagenseknek az így elkülönített és kipreparált poliszaccharid-frakcióból való előállítása a szokásos módon, a szakmában jól ismert módszerekkel történhet. A találmány szerinti eljárás gyakorlati kiviteli módjait közelebbről az alábbi példák szemléltetik. ., 1. példa Mycobacterium bovis szintetikus táptalajon a szokásos módon szaporított 6 hetes tenyészetét autoklávban 112 C°-on elöljük, majd Buchnertölcséren szűrjük és a szűrletét vízfürdőn eredeti térfogatának mintegy Vio-ére betöményítjük. Ezután a betöményített szűrletet a jelenlevő lipoidok eltávolítása céljából petrolétsrrel vagy más zsíroldószerrel kirázzuk. Az így kapott, lipoidoktól mentes vizes oldatot elektroforézises szétválasztásnak vetjük alá. A középfeszültségű papírelektroforézist Schleicher—Schüll vagy Whatman szűrőpapíron, 1300—1500 V feszültség és 40 mA áramerősség alkalmazásával, 4,2 pH-értékű ecetsavas piridin pufferrel folytatjuk le. Az egyes frakciók izoelektromos pontját és elektroforézises mobilitását az alábbi táblázat mutatja: 10 15 20 25 Frakció A B C D izoéLefc'trornos pont 6,8 9,6 3,8 9,3 mobilitás-érték —0,30 —0,20 —0,75 —0,10 A fajspecifikus tuberkulo-poliszaccharidot tartalmazó „B" frakciót a papírról 7,2 pH-értékű foszfát-pufferrel eluáljuk, az oldatot Vio térfogatra bepároljuk, majd pH-értékét az izoelektromos pontnak megfelelő 9.6-ra állítjuk be nátriumhidroxidoldat segítségével. Az oldatot ez,után +4 C° hőmérsékleten 6 óra hosszat állni hagyjuk. E pH-értéken Végbemegy a fehérje-poliszaccharid kötés hidrolízise és a fehérje csapadék alakjában kiválik az oldatból. A csapadékot azután centrifugálással eltávolítjuk és a fajspecifikus poliszaccharid hatóanyagot tartalmazó oldat pH-értékót 7,2-are állítjuk. Az oldatból a poliszaccharidot ötszörös térfogatú absz. alkohol hozzáadásával kicsapjuk vagy az oldatot Sephadex G 25 gélt tartalmazó oszlopon sómentesítjük. Az oszlopról 7,2 pH-értéken 40 45 eluált tiszta poliszaccharid-frakciót bepárlással koncentráljuk. A kapott tiszta poliszaccharid a M. bovis fertőzés faj specifikus diagnosztikuma, amely más Mycobacterium-fajjal fertőzött állaton nem ad pozitív tuberkulin- (ill. szerológiai) reakciót. A tiszta poliszaccharid legkisebb hatásos adagját fertőzött tengerimalacok vagy nyulak bőrén a szokásos niódon titráljuk és ennek alapján készítjük el önmagában ismert módon a diagnosztikai reagenst. 2. példa Az 1. példában leírthoz hasonló módon járunk el, de kiindulóanyagként a Mycobacterium avium szintetikus táptalajon szaporított 4 hetes tenyészetét alkalmazzuk. A leírt módon lefolytatott papírelektroforézis során az alábbi frakciókat kapjuk: . 55 80 Frakció a b c izoeliekitromos pont 6,6 9,0 4,2 mobilitás-érték 0,00 —0,28 —0.84 A fajspecifikus tuberkulo-poliszaccharidot tartalmazó „b" frakciót a papírról 7,2 pH-értékű 30 foszfát-pufferral eluáljuk, az oldatot Vio térfogatra bepároljuk, majd pH-értékét a frakció izoelektromos pontjának megfelelő 9,0-ra állítjuk be. A továbbiakban az 1. példában leírt módon eljárva, a Mycobacterium avium általi fertőzés 35 kimutatására-, alkalmas fajspecifükus diagnosztikai reagenst kapunk. 3. példa A Mycobacterium bovis vagy M. avium 4 hetes Sautontenyészetét hővel, autoklávban elöljük, majd a baktérium-testeket centrifugálással elkülönítjük és az így kapott baktérium-üledékből a lipoidokat zsíroldószerrel kivonjuk. A baktérium-üledékből a lipoidokat zsíroldószerrel kivonjuk. A baktérium-üledékhez e célból éter és etanol 1:3 arányú elegyét adjuk, vízfürdőn az oldószerelegy forrpontjáig melegítjük, majd az oldószert dekantáljuk és friss oldószereleggyel 50 helyettesítjük. Többszöri felrázás mellett szobahőmérsékleten 48 óra hosszat állni hagyjuk, eközben az oldószert még egyszer cseréljük. Ezután az oldószerelegyet ismét dekantáljuk, a baktérium-üledékhez 10 rész izopropilalkoholt adunk és 2 napig 37 C° hőmérsékleten állni hagyjuk. Az oldószer eltávolítása után a baktériumtömeghez mintegy tízszeres mennyiségű n/20 sósavoldaitotadunkés 100 C° hőmérsékleten 50—60 percig hidrolizáljuk az anyagot. Ezután a nem oldódott részt centrifugálással elkülönítjük és az oldatból az egyes fehérje-frakciókat az 1. ill. 2. példában megadott izoelektromos pontoknak megtelelő, pB-értékek növekvő sorrendben való beállításával egymás után kicsapjuk és 65 elkülönítjük. "3