158004. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2'-amino-2'-dezoxi-kanamicin előállítására
158004 9 10 Az 1. ábra a 2'-amino-2'~deoxi-kanamicin 1 mg/ml koncentrációjú vizes oldatának ultraibolya abszorpciós spektrumát mutatja be. Abszcissza: hullámhossz, rn.fi , ordináta: abszorpció. A 2. ábra a 2'-amino-2'-deoxi-kanamicin Nujoi-ban felvetít infravörös ialbszoirpiciós spektrumát mutatja be. Abszcissza: hullámszám (cm-1), ordináta: transzmisszió %. Az 1. és 2. ábrákkal kapcsolatban megjegyezzük, hogy a 2'-.amino-2'-<deoxi-kanarnicin a 220— 340 m/x hullámhosszú ultraibolya tartományban nem abszorbeál, azonban a következő hullámszámértékeknél a spektrumokban jellemző abszorpciós sávok jelennek meg: 3600, 3000, 1650, 1600, 1570, 1140, 1110, 1095, 1090, 1060, 1035, 960, 900, 895, 880, 845, 815, 790, 780, 765, 725 cm-1 . A . találmány szerinti eljárás egyik foganatosítási módja szerint alkalmazott Streptomyces kanamyceticus 0—4—1 törzset az ATOC intézetnél (Washington D. C.) 21252 szám alatt helyeztük letétbe. Az eljárás másik kiviteli módja szerint felhasznált A—4—6, 3AG, 18—8 és 19—2 Streptomyces ikamiamyceiticus mutánsokat ugyancsak az ATOC intézetnél, 21260, 21259, 21261 illetőleg 21268 szám alatt helyeztük letétbe. Mint már korábban említettük, a Streptomyces kanamyceticus A—4—6, 3AG, 18—8 és 19—2 mutánsai — a 0—4—1 alapftörzstől eltérően, amely a xilózt nagymértékben hasznosítja — xilózt egyáltalán nem, vagy csak kis mértékben használnak fel. Az A—4—6 mutáns továbbá — a 0—4—1 alaptörzzsel ellentétben — deoxistreptamint nem tartalmazó szukróz—Czapek agar lemezen nem növekszik. A 3AG mutáns 3-amino-glükózt tartalmazó Czapek-agar lemezen lényegesen nagyobb telepeket képez, mint a 0—4—1 alaptörzs. A találmány szerinti eljárásban alkalmazott 18—8 és 19—2 mutánsok — a 0—4—1 alaptörzs nagy dulcitfelhasználásával ellentétben — a dulcitot nem, vagy csak kis mértékben hasznosítják. Az A—4—6, 3AG, 18—8 és 19—2-mutánsokat a következőkben ismertetésre kerülő mutagen és szűrő eljárással állítjuk elő: Az A—4—6 mutáns előállítása céljából a Streptomyces kanamyceticus 0—4—1 törzset a következő kezelésnek vetjük alá: Ferde szukróz-Czapek agar felületét Streptomyces kanamyceticus törzzsel oltjuk be, majd a tenyészetet 7 napon át 28 C°-on inkubáljük. A kapott tenyészetből platinakacsnyi mennyiséget kiveszünk, és ezzel egy 70 ml-es kémcsőben levő, 7-ies pH-jú, 1% kukoricalekvárt és 0,25% szárított élesztőt tartalmazó 10 ml folyékony közeget oltunk be. 350 fordulat/perc fordulatszámú, 2 cm-es forgási amplitúdójú lengő rázógépen 28 C°-on 24 órán át rázott tenyésztést végzünk. A tenyészetet azután 10 percig 2000 10 g terhelésű centrifugán centrifugáljuk, és a felső folyadékréteget elöntjük. A kapott micéliumlepányt térfogatával azonos mennyiségű 0,9%-os fiziológiás konyhasó oldattal kétszer mossuk, és a kapott nedves micéliumot 0,9%-os fiziológiás konyhasó oldatban szuszpendáljuk. A kapott 5 ml térfogatú szuszpenzióhoz 4 ml, Ví mólos Na2 HP0 4 oldatot adunk, és a kapott elegyet 1 ml 500 mcg/ml koncentrációjú nitrogénmustároldathoz adjuk, majd 10 percig állni hagyjuk. A fentiek szerint kapott elegyből 1 ml-t 9 ml, 0,2% glicint és 0,17% NaHCOs -t tartalmazó közömbösítő oldathoz adunk és az elegyet kb. 1 órán át szobahőmérsékleten állni 15 hagyjuk. A micéliumlepényt centrifugálással elválasztjuk, öblítjük, ^majd a teljes micéliummennyiséget 10 ml kukoricalekvárt tartalmazó 70 ml-es kémcsőbe helyezzük. Ezután a már ismertetett módon 28 C°-on 24 órán át rázott tenyésztést végzünk. A tenyészetet kétszer öblítjük, hígítjuk, imajd a tenyészettel 100 mcg/ml deoxistreptamint tartalmazó szukróz—Czapek agar lemezt oltunk be. 10 napon át 28 C°-on végzett inkubálás után telepek fejlődnek. 20 25 S0 35 40 45 50 55 60 65 Minden telepből kismennyiségű micéliumot eltávolítunk, és a micéliumokkal egy 70 ml-es kémcsőben 10 ml kükoricalekvárt oltunk be, majd a fent leírt módon 28 C°-on 24 órán át rázott tenyésztést végzünk. A kapott tenyészetet kétszer öblítjük, hígítjuk, majd szukróz—Czapek agar lemezeket, ill. 100 mcg/ml deoxistreptamint tartalmazó szukróz—Czapek agar lem-ezeket oltunk be a tenyészettel. 28 C°-on 7 napon át végzett inkubálás után telepék fejlődnek. A kizárólag az utóbbi lemezen növekedő telepéket elkülönítjük, s így a Streptomyces kanamyceticus A—4—6 mutánsát kapjuk. E nagy deoxistreptamin-igényű mutáns a fejlődött «telepek kb. 1%-át teszi ki. A 3AG mutáns előállítására a. 0—4—1 alaptörzset az alábbi kezelésnek vetjük alá: Ferde szukróz—Czapek agar felületét Streptomyces kanamyceticus 0—4—1 tenyészettel oltjuk be, és 7 napon át 28 C°-on inkubáljük. A kapott tenyészetből platinakacsnyi mennyiséget kiveszünk, és ezzel egy 70 ml-es kémcsőben levő, 1% kukoricalekvárt és 0,25% szárított élesztőt tartalmazó folyékony táptalajt oltunk be. 350 fordulat/perc fordulatszámú, 2 cm-es forgási amplitúdójú lengő rázógépen 28 C°-on 24 órán át rázott tenyésztést végzünk. A tenyészetet ezután fiziológiás konyhasó oldattal kétszer mossuk, majd 50 mcg/ml koncentrációjú nitrogénmustár oldattal kezeljük. Az így kezelt törzs mieéliumaival 3-amino-glükózt tartalmazó Czapek-táptalajt (a táptalaj 3% szukróz helyett 3% 3-amino-glükózt tartalmaz) oltunk be, majd a fent ismertetett módon 28 C°-on 24 órán át rázott tenyésztést végzünk. A fejlődött micéliumot centrifugálással elválasztjuk a tenyészettől, és a micéliumokkal a növekedés meggyorsítása érdekében kukoricalekvár-táptalajt oltunk be. A korábban leírtak szerint 28 C°-on 24 órán át 5
