157984. lajstromszámú szabadalom • Eljárás parvulinok előállítására

5. 157984 6 mázható legelőnyösebben. N-íorrásként szójaliszt, kukoricalekvár, mogyoiróliszt, továbbá kazein alkalmazható. Ásványi sóként NaOl-t, OaCOa-t stb. alkalmazhatunk előnyösen. A törzs fenntartását előnyösen burgonyakivonat-gklükóz-agaron végezhetjük. Termelőképességét antibiotikum-tartalmú táptalajon végzett UV-besugárzás igen kedvezően befolyásolja. A parvulin termelése bármely hőmérsékleten végbemegy, amelyen a Streptornyces parvulus var. parvuli kielégítő növekedése elérhető (24— 32 C°), előnyös a hőmérsékletet 26 C° és 30 C° között tartani. A táptalaj sterilezését 120—125 C°-on 20—45 percen keresztül célszerű végezni. Steriltezés előtt a pH-t célszerű 7,0-ra állítani. A steril táptalajt a Streptomyces parvulus var. parvuli spóraszuszpenziójával vagy vegetatív inokulumával oltjuk be. A vegetatív inokulium készítéséhez használt táptalaj összetétele á fermentációs ''táptalajéval ••azonos. Az indkulum mennyisége a főfermentációnál a beoltásra kerülő táptalaj térfogatának 5—10 százaléka. A fermentáció során az •antibiotikum-tartalom a 48. órában éri el a 400—600 y/ml értéket. A 70—72. órában mintegy 5—1,0%-os fragnientáció figyelhető meg gyenge spórázás mellett. A fermentlé hatóanyagtartailma 1000—1400 y/ml. A pH érték a glükóz fogyásával párhuzamosan emelkedik, ekkor az antibiotikum-termelés szempontjából célszerű további glükózt adagolni. A 96. órában 20—30%-os fragmentáció, ugyanakkor másodlagos növekedés figyelhető meg. Az aktivitás eléri az 1800—2100 //ml-t. A további termelésit a második mikroorganizmus-generáció adja. A maximális antibiotikumszintet (2400—2600 y/ml-t) a 120. órában érjük el. A mikroszkopikus képben 40—50% fragmentáció, iá micéliumok merevedése, spórázás figyelhető meg. A pH érték 7,6—8,l-re emelkedik. Az antibiotikum az erjesztéses oldat pH 3,2.— 3,6-on történő szűrésénél a sejtáltományban halmozódik fel, melyből extrakciós (módszerekkel vontató ki. A nedves milécium extrahálását vízzel legalább részlegesen elegyedő neutrális, szerves oldószerekkel!, pl. alkoholokkal' (metilalkohol, etilalkohol, butanol stb.), ül. acetonnal végezhetjük. Az antibiotikum az oldószeres kivonat bepárlási maradékából valamely kevéssé poláris oldószerrel, így étilaoetáttal, éterrel vagy acetonnal kicsapható. A savas jelegű parvulin butanolos oldatából pH 7—9 között só formában vizes oldatba vihető, majd az izoelekitromos pontjának megfelelő pH 3,4—3,6-on ismét mint szabad sav, szerves fázisba vihető át. Ez utóbbi eljárás többszöri megismétlésé a parvulin tisztításánál eredményesen alkalmazható. A parvulin vizes oldatából a vízben nem oldódó sói leválaszthatók, így pl. kalciumklorid, ólomacetát hozzáadásával a kalcium- vagy ólomsója, de hasonlóan előállíthatók az ezüst, illetve egyéb fémekkel alkotott sói is. A fenti úton előállított, ill. tisztított parvulin klaroform-metanol-0,02 n HCl (2 : 2 : 1) vagy szekunder butanol-etilacetát-jmetanol-pH 3,5 puffer (2:8:3:7) rendszerben 440 lépcsőben végzett Oraig megoszlás, valíamint kromatográfiás vizsgálatok alapján nem tekinthető egységes anyagnak. Az egyes komponensek szétválasztására eredményesen alkalmazható a szilíkagéL-oszlopon végzett adszorpciós kromatográfia, melyet metanolt növekvő százalékos arányban tartalmazó kloroform rendszerben végzünk. így a parvulin három komponensre bontható szét (jelzésük A, B, C, arányuk 6 : 1 : 1). A legnagyobb menynyiségben jelenlevő A komponens mellett két kisebb mennyiségű, hasonló peptid-jellegű aktív anyagot tartalmaz. Az egyes komponensek kvalitatív és 'kvantitatív aminosav összetétele (110 C°-oin 16 óráig, 6 n HCl-ben végzett hidrolízis alapján) a következő: Parvulin A: aszparagin.sav (4), glicin (3), prolin (1), valin (2), pipekolsav (1), a,'/?-diaminoyajsav (2), Parvulin B: aszparaginsav (4), glicin (2), prolin (1), valin (1), pipekolsaiv (1),«:,'/? diaminovajsav (1), Parvulin C: aszparaginsav (4), glicin (1), prolin (1), pipekolsav (2), a, ß diaminovajsav (2). A C komponens valint nem tartalmaz. Mindhárom komponens tartalmaz egy nem azonosított aminosavat, továbbá 12—13 szénatomszámú zsírsavakat. Az egyes komponensek elemi analízis értékei: Parvulin A: C 50,99—51,20% H: 7,50— 7,55% N: 12,03—12,21% Parvulin B: C: 48,92—49,05% H: 7,21— 7,43% N: 9,95—10,17% Parvulin C: C: 51,22—51,30% H: 7,78— 7,80% N: 10,96—4.1,00% A parvulin komplex baktériumellenes hatása a következő: Staph, "aureus 53* 6 y/ml. Staph, aureus 80/81** 6 y/ml. '' Staph, aureus 1115** 6 y/ml. 55 Staph, aureus Duncan 6 y/ml. Sarcina lutea 0,8 y/ml. Bac. subtilis ATTC 6633 0,8 y/ml. Streptococcus faecalis 50 y/ml. Pseud, pyoicyaneus 100—1000 y/ml. 60 E. coi'i 0111 100—1000 y/ml. E. coli 6R 100—4000 y/ml. Candida alb. hatástalan * = polirezisztens (rezisztens penicillinekkel, streptomicinekkel és polimixinnel szemben) 65 ** = penicillin-rezisztens. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3