157738. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a glükózoxidáz fermentációs úton történő előállítására és tisztítására, továbbá kataláz előállítására

157738 ti aktivitás pedig 100—400 SE/g. A micéliumsejtek feltárására golyósmalmot alkalmaztak. Hanus és munkatársai (Közp. Élelmiszerip. Kut. Int. munkáinak gyűjteménye, No 12, 1963) frakcionált ammóniumszulf átos kicsapással nyerték ki az enzimet. Ez az eljárás azonban eléggé nehézkes és hosszadalmas. Az ily módon nyert enzimet dietilaminoetil-eellulóz, a továbbiakban DEAE-cellulóz oszlopon tisztították. (Hanus, M. és Műnk, V., V. Nemzetközi Biokémiai Kongresszus közleményei). A DEAE-cellulóz oszlopról Na2HP04 0,005 mól-ról 0,6 mól-ig növekvő koncentrációjú oldatával eluálták a glükozoxidázt. Pokrovszkaja (Mikrobiológia, 31, 788, 1962) Penicillium notatum, P. vitale, P. chysogenum és különböző Aspergillus niger törzséket hasonlított össze glükózoxidáztermelés szempontjából. Legjobb eredményt P. vitale törzzsel ért el, glükózoxidáztartalmú szintetikus táptalajon, 6—7 napos tenyészidő alatt. A Penicillium tenyészet szűrletéből acetorinal, vagy etilalkohollal csapta ki az enzimet, amelyet a nagy kalciumglükonát tartalomtól dialízissel tisztított meg. A preparátum aktivitása rendkívül alacsony, 40—60 E/g volt. Pokrovszkaja és munkatársai (Ferm. Szpirt. Prom. 5, 21, 1966) a nyers glükózoxidáz készítményeket oly módon tisztították, hogy azok kataláztartalmát különféle koncentrációjú etilalkohol-víz, ill. aceton-víz eleggyel való szelektív kicsapással nagy mértékben csökkentették. Coulhard és munkatársai (Biochem. Journal, 39, 24, 1945) az enzimet acetonnal, tanninnal, Reinecke-sóval és ammónium-szulfáttal csapták ki a vizes szuszpenzióból. Kitermelésük meglehetősen rossz volt, a preparátum pedig csak részlegesen tisztított.) A jelen találmány célja a glükózoxidáz előállítása során a fenti hátrányok kiküszöbölése, nagy micéliumhozam és magas aktivitás elérése, továbbá a glükózoxidáz mellett tiszta kataláz előállítása. [A találmány tárgya eljárás glükózoxidáz fermentációs úton történő előállítására és tisztítására, továbbá kataláz előállítására. A találmány szerinti eljárással a glükózoxidáz előállítását oly módon végezzük, hogy természetes vagy félszintetikus táptalajt az Aspergillus niger törzs 1026/10/C2 UV variáns (deponálási szám: 45/1968. IV. 3.) 24 órás vegetatív tenyészetének 10%-ával beoltunk és állandó intenzív keverés és levegőztetés mellett 27—30 C°, előnyösen 28 Cc hőmérsékleten és 1—2 atm. nyomáson 16—24 órán át fermentáljuk, majd a tenyészetet centrifugáljuk, az így kapott micéliumtömeget mossuk, vízzel 1:1,5—1:7 arányban hígítva gyöngymalomban feltárjuk, a kapott szuszpenziót szűrjük és a szűrletét láofilizáljük, vagy, a szűr létből az enzimet izopropilalkohollal kicsapjuk és szárítjuk. A fermentáláshoz, általában előnyösen 5—15% melaszt, 1—3% kukoricalekvárt, 0,5—1,0% szuperfoszfátot, 0,3—1,0% ammóniumnitrátot és adott esetben egyéb ásványi sókat tartalmazó 5 természetes táptalajt használunk. Bizonyos esetekben előnyösebbnek mutatkozik a melaszt szacharózzal helyettesíteni. Ilyenkor a következő összetételű félszintétikus táptalajt használjuk: 2,5—7,5% szacharóz, 1—3% ku-10 koricalekvár, 0,2—1,0% kalciumnitrát 0,010— 0,030% káliumdihidrogénfoszfát, 0,010—0,030% magnéziumszulfát és 0,02—0,08% citromsav. A glükózoxidáz analitikai célokra való tisztítása és a kataláz előállítása céljából a fenti ter-15 mékből vizes oldatot készítünk, azt DEAE-cellulóz oszlopon adszorbeáljuk, 4,5 pH-értékű 0,07 mólos acetátpufferral eluálva a kísérő enzimeket: a katalázt és az amilázt elkülönítjük, majd a glükozoxidázt 3,7 pH-értékű 0,1 mólos acetát-20 pufferral eluáljuk, s az így kapott tiszta glükózoxidáz oldatot 20—32 C° hőmérsékleten, vákuumban térfogatának 1/10 részére bepároljuk. A kataláz előállítása céljából úgy járunk el, hogy a fenti kataláz- és amiláztartalmú eluátu-25 mot Sephadex G—150 vagy G—200 oszlopra felvisszük, majd a katalázt és az amilázt 5,1 pH-értékű 0,05 mólos acetát-pufferral frakcionáltan eluáljuk. S0 A kataláznak a találmány szerinti elkülönítését az irodalom eddig még nem ismertette. A találmány szerinti eljárás előnye, hogy a fermentálást a fenti Aspergillus niger törzzsel végezve a fermentációs idő az eddig ismert eljárásokéhoz képest lényegesen csökkent, a micéliumhozam és a micélium aktivitása pedig az eddigi eredményeket jelentősen felülmúlja. A micélium kiszűrése után a fermentlé glükózoxidáz aktivitása igen kicsiny, 2—7 SE/ml, feldolgozása glükózoxidáz előállítása céljából a kis aktivitás és nagy volumen miatt nem gazdaságos. A találmány szerinti eljárás további előnye, a micéliumnak gyöngymalomban végzett feltárása. Ismeretes, hogy az endo-enzimek mikrobasej-4 tekből való kinyerése a biotechnológiában elég nagy problémát jelent. A sejtek olyan mértékben való szétroncsolása, hogy a bennük levő enzimek nagy része károsodás nélkül extrahálható legyen, nehéz feladat, az ősi módszernek számító 0 kvarchomokos dörzsölés nehézkes, gépi úton nem megoldható. Az elterjedten alkalmazott, golyósmalomban való sejtfeltárás hosszadalmas, s emellett rossz hatásfokú. Eljárásunk során a micéliumsejtekét — az eddigiekben biotechnológiai 55 célra még nem alkalmazott — folytonos működésű gyöngymalomban tártuk fel. A készülék munkatere 3 mm átmérőjű üveggöngyökkel van megtöltve. A gyöngyoszlopot 0 nagyteljesítményű tárcsás keverő tartja állandó mozgásban. A micéliumszuszpenzió ezen a gyöngyoszlopon változtatható sebeséggel halad keresztül. Technológiánkban a kísérleteink során 65 a legjobb hatásfokúnak bizonyult 10 liter/óra