157693. lajstromszámú szabadalom • Stabilis reagens-elegy

157693 hatósága azon a hőmérsékleten, amelyen a meghatározásokat kell végezni, általában kb. 37 C°-on. Kísérletekkel megállapítottuk, hogy megfelelő eredményeket kapunk, ha a mintához adandó, vízzel hígított reagens minden ml-éhez néhány mg adalékot adunk és akkor is, ha az adalékot víziben való oldhat óságának megfelelő mennyiségben adagoljuk. Mamiit esetében ez a tartomány -25—180 mg/ml vízzel hígított reagens. Ezenkívül megfelelő pufferek és fém aktívátoirok adhatók a reagenshez reagens-keverék készítéséhez. Vizsgálat céljára káváiaisatunk egy csomagolást, amely a meghatározás elvégzéséhez szükséges reagenseket tairtalmazaa. A csomagban levő reagenseik előre le vannak mérve és előzetesen megbatározott aktivitásúak. Ennek ímegfelélően a reagens folyékony reagens készítéséhez standard mennyiségű víziben közvetlenül feloldható. Ezt a folyékony reagenst ezután összekeverjük a biológiiai mintával enzimatikus reakció létrehozására. A reakciósebesség az eredetileg ísimeretüen anyag aktivitása nagyságának a függvénye. A találmány szerinti meghatározás egy előnyös foganaitosítási módja szerint a reagenst folyékony reagens készítése céljából feloldjuk és összekeverjük a mintával. A szubsatrátum reagál az ismeretlen mennyiségű enzimmel. A reagensben levő szubsztrátum elegendő menynyiségben van jelen ahhoz, hogy konstans sebességgel reagáljon. Ennek eredményeképpen az egyetlen olyan tényező, amely meghatározza a reakciósebességet, a meghatározandó ismeretlen enzim aktóviitásániak nagysága, A sziubsatnátum reakcióba lép és az észterkötés felhasiad. A szubsztaátam átalakulásának mentiekéit a reakció eJőreJhaladásának méntéke határozza meg. A sízubsztráítum p-nitrofienil-foszforsaviból könnyen p-nátrofienoíEá alakulhat. A szubsztrátum a fényt más hulMmhoszszón nyel el, minit a termék. így, ha lemérjük az opítákai sűrűséget a itöviálasztotit huMmfooszszon, az átalakult szubsztrátium mennyisége meghaitároaható. KJözeletobről, ha megmérjük a káválasztotít hullámhosszon az optikai sűrűség váltoaásáoalk mértékéit vagy sebességét, meghatározhatjuk a reakoio sebességét Azt tapasztaltuk, hogy a p—<NPP-«Ä 300 m/* és 415 vau. közötti tartományban átlátszóak, míg az átalakult alak (pnnitnofienol) 390 mp, és 420 m/x között mutat elnyelést, alkalikus oldatban a maximum 405 rmi hullámhosszon van. Ha ezt a saUbsátrátumot alkalmazzuk, a reakciót oly módon köivethatjük, Ihogy randire lemérjük az optikai sűrűséget az utóbbi hullámhossz-tartományban. A szabad p^itrofenilfoszfarsavat (p—NPP) bármely szokásos 'eljárással előállíthatjuk, pl. olyan módon, hogy a p—NPP alkálifém-sójét H+-ciklusban levő ikátioncserélő gyantán, pl. Dowex 50 gyantán átiboesájtljuk. Általában a p-niltrofenilfoszforsavak amin-sőit szintén meg-10 15 20 ;Í0 35 40 kaphatjuk oly módon, hogy a p-niitrofienil-foszforsav alkálifénnaóját megfelélő aminnal reagáltatjuk, így a p^nitrofenill-fosztfoírsav aminsójiát leválaszthatjuk töményítéssel vagy szerves oldószer hozzáadásával. Eljárhatunk úgy is, hogy a szabad p-niitrofenii-foszforsavat oldatbian a megfelelő aminnal semlegesítjük és szerves oldószer hozzáadásával lecsapjuk vagy bepárölju'k, amíg a kristályosodás meg nem kezdődik. A megfe-Mő p-initrofienil-foszforsav amin-sót moasuík, össze-, gyűjtjük és szárítjuk. Az, hogy melyik speciális amin^sót alkalmazzuk, aititál függ, hogy melyik áll rendelkezésre és az mennyire képes a meghatározás körülményei között a p—NPP-4 stabilizálni. A sók általában az alábbiak: alifás aminők, aliciklusos allkilaiminök, Ihidroxialkilaiminok, arilaminok és aralkilaminok. Az allkilaminok monoallfcil-, dialfcil- és trialkilamánofk lelhetnek, az alkilcsoiportok 1—18, előnyösen 1—6 saénatamosak. Küflönöísen alkalmasak a metilamin, etilamin, itributilamin és dipropilamin. Az alioiklusos alkiilaminok pl. az alábbiak lehetnek mono-ciklohexilamán, diciklohexilamin és triciklohexilamin. A hidroxiaflkilaminak 2—12, előnyösen 2—6 szénatomosak lehetnek, pl. monoetanolamin és 2--amino-2-fódroximeítil-l,3-propándiol. Az aralkilaminak 5—15, előnyösen 7—9 szénatomosak lehatnék, pl. a rnonoihenzilamin. A találmány szerinti reagensiek előállítását és alkalmazását az alábbi példákkal szemléltetjük. 1. példa: Di^cákldhexiüiammóniium)-p-niitro£enil-foszfát előállítása 45 12,5 g nagy tisataságú dimataiumnp-inditnafenii^ foszfélt 50 ml vízzel fcészíitieitt oldatát 12)5 ml-^es, hidrogénion alakú kationeserélíő gyanlta-, így Dowex 50 (50—100 mesh) gyarataoszlopon bocsáttjuk keresztül. Ezután az oszlopot 200 ml vízzel mossuk. Az oszloipcról elfolyó oldart-hoz 10 g aikldhextoimint adunk. Az oldatot csökkenteltít nyomáson 25 mlnre bepárűljuk és 400 ml acetont adunk hozzá. Az elegyet ezután 2 órán át 0 C°-on tartjuk, niajd a csapadékot szűrőn összegyűjtjük és acetonnal mossuk. A termékét vákuumban állandó súlyig szárítrjuk. Hozam: 8 g p-niitrofenil-foszfOirisav diciklohexilaminsQ. 60 2. példa: p-Nitrofenilfoszforsav tirisz-(hidroxiimetil)-aminiomatán-só előállítása : 12,5 g nagy tisztaságú diniátrium-p-nitrofe-65 nilfoszfát 50 ml vízzel készített oldatát 125 ml-