157628. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hipoallergén tetraciklin antibiotikumok előállítására

3 157628 4 szerekkel bájtjuk végre. E célra pl. gél-szűrést, dialízist vagy hiperszűrésre szolgáló membránokat alkalmazhatunk; e membránok szintetikus, természetes vagy módosított természetes eredetűek lehetnek és adott esetben polielektiriolitikus funkcionális csoportokat tartalmazhatnak. Különösen előnyösnek bizonyult a gél-szűrési eljárás, melynél oly molekuláris szűrőanyagot alkalmazunk, mely a cukor erjesztése útján nyerhető dextrán oly módosított származéka, melyben a dextrán lineáris makromolekulái hídkötések útján egymáshoz kapcsolódnak és így a poliszacharid láncok háromdimenziós térhálós szerkezete alakul ki. Egy kereskedelmi forgalomban beszerezhető és e célra jól alkalmazható ilyen termék „Sephadex" néven ismeretes. Egy másik alkalmas molekuláris szűrőanyag a „Biogél" néven kapható poliiakrilamid . gél. A kiindulási antibiotikumban a szennyezés oly módon mutatható ki, hogy az anyagot az antibiotikum eltávolítása céljából csapvízzel szemben dializáljuk, a visszamaradó anyag oldatát betöményítjük, hidrolizáljuk, majd a kapott aminosavaikat ioncserélő oszlopon végrehajtott kromatografálással elemezzük. Ezzel az eljárással kimutatható, hogy míg a nem-tisztított antibiotikum esetében dialízis és hidrolízis után számos, a fehérjékben általánosan előforduló aminosavat kapunk, addig tisztítás után ilyen aminosavak nem mutathatók ki csupán olyan amino-vegyületek, melyek az antibiotikum lebontása során képződnek. Másik módszer szerint az izolált szennyezőanyagot megfelelően szenzibilizált állatokon a passzív kutan anafilaxiás teszt-nek (PCA teszt) vetjük alá. Eljárásunk további részleteit a példákban ismertetjük anélkül, hogy találmányunkat a példákra korlátoznánk. 1. példa: 10 g kereskedelmi minőségű tetraciklin-hidroklorid mintát vízben oldunk, az oldatot cellulóz-aoetát dializáló kádba töltjük és folyó Gsapvízzel szemben 5 napon át dializáljuk. A kádban visszamaradó anyagot fagyasztva szárítjuk és egy részét megfelelően szenzitizált tengeri malacokon a PCA teszt céljaira felhasználjuk. A kapott folt- és erythema-reakició antitest-antigén reakciót mutat. A visszatartott anyag többi részét evakuált zárt csőben fölös menynyiségű 6 n sósavval 110 C°-on 22 órán át hidrolizáljuk. A cső tartalmát vákuumíban szárazra pároljuk, a maradékhoz 10 ml vizet adunk és a bepárlást megismételjük. A maradékot vízzel 10 ml-re feltöltjük és egy alikvot részt Beckman Spinco 120C model aminosav-analizátor felhasználásával efemzünk. A kapott kromatogramok számos, fehérjéikben általában előforduló aminosav jelenlétét mutatták. 2. példa: Az 1. példában kiindulási anyagként felhasznált tetratiklin-hidnoklorid 10 g-os mintáját 5 100 ml víziben oldva cellulózacetát dializáló kádba töltjük és 1,5 liter, desztillált vízzel keverés közben 5 C°-on dializáljuk. A dialízis befejezése után a dializátumot fagyasztva szárítjuk, mikoris fehérjeszerű szennyezőanyagoktól men-10 tes tetracikMn-íhidroMoridot kapunk. Ezt oly módon igazolhatjuk, hogy a tisztított terméket /. az 1. példában leírt eljárással kezeljük, mikoris a végső kromatogram nem mutat fehérje-hidrolízis eredményeként képződő aminovegyületeket. 3. .példa: Az 1. példában kiindulási anyagként felhasz-20 nált tetraciklin-hidroklorid 10 g-os mintáját 100 ml vízben oldva Sephadex G—25 oszlopon (11,5X125) átvezetjük és az oszlopot vízzel frakcionáltan eluáljuk, miközben az eluátum optikai sűrűségét 254 m/i-nál folyamatosan ellenőrizzük. 25 A fehérjeszerű szennyezőanyagokat tartalmazó első frakciókat elöntjük, a többi frakciót egyesítjük és fagyasztva szárítjuk. A kapott tetraeiklin-hidroklorid a PCA-teszt és hidrolízis, majd aminosav-analizátorral végzett elemzés 30 szerint hipoallergén. 4. példa: Valamely Streptamyces aureofiaciens törzs megfelelő táptalajon képezett tenyészetéből kapott 1 liter szűrt és derített fermentlevet hiperszűréssel, 2 atm nyomáson az 1000-nél nagyobb molekulasúlyú anyagok eltávolítására alkalmas szintetikus membránon átvezetünk. A szűrletben levő klórtetaaciklint kalcium-származékán keresztül izoláljuk és a hidrokloridot sósavas kezeléssel kapjuk. A PCA-teszt és aminosav-analizátor alkalmazásával összekapcsolt hidrolízis azt mutatta, hogy a termék hipoallergén. 5. példa: 5 g oxitetraciklin-JhidrokOiorid 20 ml vízzel készített oldatát egy cellulózaoetátból készült dializáló Zsákba helyezzük: és 500 ml keverésben tartott desztillált vízzel szemben 5 C° hőmérsékleten dializáljuk. 16 óra múlva a dialízist megszakítjuk és a dializátumot fagyasztó szárításnak vetjük alá. Ily módon 2,6 g oxitetraciklin-ihidroklaridot kapunk, amely mentes a nem dializáiható fehérjéktől. 6. példa: 2 g demetiltetracikHn-tódroklond 25 ml vízzel képezett oldatát hiperszűrű-membránon (az Ami-P5 con Corporation oég Grade UM2 jelzésű gyárt-2