157627. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tisztított antibiotikumok előállítására

3 157627 4 Különösen előnyös a gél-szűrés, melynek során oly molekuláris szűrőanyagdkat alkalmazunk, melyek a cukor erjesztése útján nyerhető dextrán oly módosított származékai, melyekben a dextrán lineáris makromolekulái hídkötéseik útján egymáshoz kapcsolódnak és így a poliszacharid-Mnook három-dimenziós térhálós szerkezete alakul ki. Egy kereskedelmi forgalomban beszerezhető és e célra jól alkalmazható ilyen termék „Sephadex" néven ismeretes. Egy másik előnyösen felhasználható molekuláris szűrőanyag a „Biogél" néven kapható poliakriamid gél. A kiindulási antiibiotikumbam a szennyezést oly módon mutathatjuk ki, hogy az anyagot az antibiotikum eltávolítása céljából csapvízzel szemben dializáljük, a visszamaradó oldatot betöiményítjiük, hidrolizáljuk, majd a kapott aminő-savakat ioncserélő gyantán végrehajtott kromatografálással elemezzük. E módszerrel kimutathatjuk, hogy nem-tisztított antibiotikum esetében dialízis és hidrolízis után számos, a fehérjékben általánosan előforduló aminosavat kapunk, míg tisztítás után ilyen aminosavak nem mutathatók ki, csak olyan amino-vegyületek, melyek az antibiotikum lebontásakor képződnek. Más módszer szerint az izolált szennyezőanyagot megfelelően szenzibilizált állatokon a passzív kután anafilaxiás teszt-nek (PCA teszt) vetjük alá. Eljárásunk további részleteit a példákban ismertetjük, anélkül, hogy találmányunkat a példákra korlátoznánk. ben 500 ml desztillált vízzel 5 C°-on dializáljük. A dialízis teljessé válása után a dializátumot fagyasztva szárítjuk, mikoris fehérjeszerű szennyezőanyagoktól (mentes sztreptomicin-5 -hidrokloridot kapunk. Ezt oly módon igazoljuk, hogy a tisztított terméket az 1. példában leírt eljárással kezeljük; a végső Ikromatogram nem mutatta ki a fehérjék hidrolízisekor képződő aminosavak jelenlétét. 10 3. példa: Az 1. példa szerint felhasznált sztreptomicin-15 -hidroklorid 10 g-os mintáját 50 ml víziben oldva Sephadex G—25 oszlopon (11,5X125 cm) átvezetjük és az oszlopot vízzel fnakcionáltan eluáljuk, miközben az eluátuim oíptikai sűrűségét 254 m/x-nél folyamatosan ellenőrizzük. Az 20 első frakciiók fehérjeszerű szennyezést tartalmaznak és ezeket elöntjük. A többi frakciót egyesítjük és fagyasztva szárítjuk. A kapott sztreptomicinihidroklorid a PCA-teszt és hidrolízis, majd aminosav^analizátorral kapott ered-25 menyek alapján hipoallergénnek bizonyult. 4. példa: 30 100 g sztreptomiein-szulfát 200 ml vízzel képezett oldatát Sephadex G—25 oszlopon (11,5 X X125 cm) átvezetjük és az oszlopot a 3. példában leírt módon vízzel frakcionáltian eluáljuk. A kapott-sztreptomicin-szulfát a szokásos tesz-35 tek szerint hipoallergénnek bizonyult. 1. példa: 10 g kereskedelmi minőségű sztreptomicin-hidrokloirid mintát vízben oldunk és az oldatot cellulózacetát dializáló kádban folyó csapvízzel szemben 5 napon át kimerítően dializáljük. A kádban visszamaradó oldatot fagyasztva szárítjuk. A kapott termék egy részét megfelelően szenzitizált tengeri malacokon a PCA-teszt szerint megvizsgáljuk; az antitest-antigén reakciót a folt- és erythama-raakció jelzi. A visszatartott anyag maradék részét evakuált zárt csőben fölös mennyiségű 6 n sósavval 110 C°-on 22 órán át hidrolizáljuk. A cső tartalmát vákuumban szárazra pároljuk, a maradékhoz 10 ml vizet adunk és a bepárlást megismételjük. A maradékot 10 ml vízben oldjuk és egy alikvot részt Backman Spinoo 120 C modell aminosav-analizáló berendezéssel elemzünk. A kapott kromatogram néhány, a fehérjében általában jelenlevő aminosav jelenlétét mutatta ki. 5. példa: 40 10 g dihidrosztreptomicin-szulfát 20 ml vízzel készített oldatát egy Sephadex G—25 oszlopon (11,5X125 om) vezetjük keresztül és az oszlopot vízzel, a 3. példában leírt módon frakcionáltan eluáljuk. A dihidrosztreptamicint tar-45 talmazó frakcióból fagyasztószárítással 8,3 g tisztított terméket kapunk, amelyben nem-dializálható fehérje már nem mutatható ki. 50 6. példa: 5 g neoimicinszulfát 25 ml vízzel készített oldatát hiperszűrő-memibránon (az Amicon Corporation oág Grade UM2 jelzésű gyártmánya) 55 keresztül, 3,55 atirn nyomás alkalmazásával szűrjük. A szűrletiből fagyasztószárítással 4,2 g tisztított terméket kapunk, amely a nem-dializálható fehérjéktől mentes. 2. példa: Az 1. példában felhasznált sztreptomicin-hidroklorid minta 10 mg-ját 20 ml vízben oldva oellulózaoetát dializáló kádban keverés köz-60 7. példa: 10 g neomieiniszulfát 20 ml vízzel készített oldatát egy Sephadex G—25 oszlopon (11,5X125 65 cm) vezetjük keresztül és az oszlopot vízzel, a 2